刘佳，智慧，艾丹，杨秀华

（呼伦贝尔职业技术学院，内蒙古 呼伦贝尔 021000）

0 引言

益母草又名茺蔚，为唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的新鲜或干燥地上部分[1]。益母草药材中含有丰富的药用活性成分，包括生物碱类益母草碱、盐酸水苏碱，二萜类成分前益母草素、益母草素、前益母草素，挥发油类成分麝香草油、苦艾油，黄酮类成分芦丁、槲皮素，动物多糖有淀粉、纤维素、果聚糖、半纤维素等，植物多糖有糖原、甲壳素、肝素等[2]。据中国药典记载，盐酸益母草碱和盐酸水苏碱作为益母草质量评价指标。熊莺等人研究结果显示盐酸益母草碱和盐酸水苏碱是益母草药材中主要的活性成分[3-4]，其中盐酸益母草碱药理作用广泛。有研究表明，盐酸益母草碱可通过NF-κB信号通路抑制骨关节炎的炎症反应并改善软骨降解[5]；也可通过AMPK / SREBP1信号通路对实验性非酒精性脂肪性肝炎具有保护作用[6]；张怡等[7]研究发现益母草中的成分盐酸益母草碱能够抑制破骨细胞生成。赵懿清等[8]研究发现盐酸益母草碱能够抑制大鼠子宫的异常出血。

益母草在全国大部分地区均有分布，主产江苏、广东、广西、福建、贵州、云南、四川、内蒙古等地[9]。各地区在益母草的采收时期方面说法不一，缺乏有效依据，从而导致不同批次生产的含有益母草单位药材的成分含量不均一，影响了药品的品质。呼伦贝尔地区益母草花期为7-9月，果期为9月[10]，结合呼伦贝尔市气候特点和益母草长势情况，本研究选定从8月中旬至10月中旬之间的益母草样品作为本次研究对象，对其活性成分盐酸益母草碱进行了含量测定比较研究，以期为最佳采收时期的确定提供可参考的科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪：日本岛津LC-15C输液泵、SIL-10AF自动进样器、CTO-15C紫外检测器、SCL-10AVP工作站；KQ500-DB数控超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；BSA124S电子天平（Max=120g，d=0.1mg）赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.2 材料

盐酸益母草碱（纯度≥98%，批号：AF21072351,城都埃法生物科技有限公司）、辛烷磺酸钠（天津市大茂化学试剂厂）、乙腈为色谱纯（山东禹王和天下新材料有限公司）、无水乙醇为分析纯（山东禹王和天下新材料有限公司）、水为超纯水。

以益母草的种植驯化文献为依据，采集2021年8月15日、8月30日、9月15日、9月30日、10月15日等五个不同时期的益母草样品，晾干，在干燥阴凉处保存备用。样品采集自呼伦贝尔职业技术学院蒙药材驯化栽培实训基地。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.4%辛烷磺酸钠的0.1%磷酸溶液（45：55）；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测波长为277nm；进样量：10μL

2.2 供试品溶液的制备

取益母草样品粉末（过三号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备

取盐酸益母草碱对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1mL含30μg的溶液，即得。

2.4 方法学考察

精密量取盐酸益母草碱对照品1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL分别置于10 mL 容量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，分别吸取上述溶液10μL 进样，按照“2.1”项的色谱条件测定。以进样量X（mg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，并计算得回归方程为：y = 66933x + 10915，R² = 0.9999，结果表明盐酸益母草碱进样量在0.003～0.015mg范围与峰面积具有良好的线性关系；精密吸取盐酸益母草碱对照品溶液10μL，按照“2.1”项的色谱条件连续进样5次，测得盐酸益母草碱对照品的峰面积积分值，结果RSD值为0.78%，试验表明，仪器精密度良好；取2021年8月15日、9月1日、9月15日、9月30日和10月15日采集的益母草供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10小时进样10μL，结果RSD值依次为0.81%、0.76%、0.59%、0.65%、0.77%，表明供试品溶液在10小时内稳定性良好；按照“2.2”项平行制备2021年8月15日、9月1日、9月15日、9月30日和10月15日采集的益母草供试品，每样6份，按“2.1”项色谱条件下进行测定，进样量为10μL，结果RSD值依次为1.21%、0.98%、1.05%、1.45%、1.56%，表明该方法重复性较好。

2.5 结果

2.5.1 对照品含量测定

精密吸取按2.3项下配制的盐酸益母草碱对照品溶液，取10μL注入高效液相色谱仪测得，见图1。

图1 盐酸益母草碱对照品HPLC

2.5.2 供试品含量测定

分别取于2021年8月15日、9月1日、9月15日、9月30日和10月15日采集的益母草样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液并在“2.1”项下色谱条件下进行盐酸益母草碱的含量测定。

实验数据显示蒙药益母草中盐酸益母草碱含量最高的是2021年8月15日采集的样品，含量为0.1334%，其次依次为9月1日、9月15日、9月30日和10月15日等时间采集的益母草样品，依次为0.0867%、0.0821%、0.0797%、0.0787%。结果显示，蒙药益母草在8月中旬的开花初期时盐酸益母草碱的含量为最高，其他时期含量均显示下降趋势。图2为8月15日采集样品色谱图、图3为9月1日采集样品色谱图、图4为9月15日采集样品色谱图、图5为9月30日采集样品色谱图、图6为10月15日采集样品色谱图。表1为不同采收时期蒙药益母草中有效成分含量的测定结果。

表1 不同采收时期蒙药益母草中有效成分含量的比较

图2 8月15日采集益母草样品HPLC

图3 9月1日采集益母草样品HPLC

图4 9月15日采集益母草样品HPLC

图5 9月30日采集益母草样品HPLC

图6 10月15日采集益母草样品HPLC

3 讨论

蒙医临床上益母草具有很高的临床应用价值，主治肝热、目赤肿痛、眼白斑、云翳、结膜炎等[11]。郭巧技等人[12]通过对不同产地、不同采收阶段益母草中有效成分进行检测后发现营养期益母草质量最好，其次是童子期，花期及果期质量最差。周颖等人[13]研究发现，益母草在过了花盛期，茎秆呈枯黄、叶片缺失，有效成分盐酸水苏碱和盐酸益母草碱含量下降。本研究通过规范种植蒙药材益母草，根据文献记载的益母草采收期结合本地区益母草长势于2021年8月15日、8月30日、9月15日、9月30日、10月15日等五个不同时期采集益母草样品，以2020年版《中国药典》为依据，对益母草样品中的盐酸益母草碱含量进行了测定。结果显示8月15日采集到的益母草样品中的盐酸益母草含量最高，为0.1334%，10月15日期采集到的益母草样品中的盐酸益母草样品含量最低，为0.7873。

综上所述，益母草药材不同时期采收的有效成分含量存在差异，其中呼伦贝尔地区8月中旬采收的样品中有效成分含量最高，建议在此期间采收为宜。