大豆根特异性GmPR1-9启动子的鉴定及其在根腐病抗性中的应用

2022-12-14闫强薛冬胡亚群周琰琰韦雅雯袁星星陈新

中国农业科学 2022年20期

闫强，薛冬，胡亚群，周琰琰，韦雅雯，袁星星，陈新

大豆根特异性启动子的鉴定及其在根腐病抗性中的应用

闫强，薛冬，胡亚群，周琰琰，韦雅雯，袁星星，陈新

江苏省农业科学院经济作物研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，南京 210014

【目的】鉴定大豆根特异性启动子及其最小调控片段，并利用启动子工程技术构建时空特异人工启动子并评价其在根腐病抗性中的应用价值，为大豆抗疫霉根腐病的遗传改良提供遗传元件。【方法】通过分析大豆根、茎和叶片转录组数据，筛选在根中特异高水平表达的基因，克隆获得其启动子序列。根据顺式元件的分布位置构建截短载体，并驱动报告基因在大豆发状根组织中超表达，筛选控制根特异性表达的核心片段。将获得的核心启动子片段与疫霉菌诱导启动子元件p4XD串联构建人工启动子驱动疫霉抗性相关基因在大豆发状根中超表达，分析转基因组织对疫霉菌抗性水平及目的基因在病原菌侵染过程中的表达水平。利用转基因本氏烟草从整株水平评价转基因材料对疫霉菌的抗性水平。【结果】通过筛选发现6个大豆根特异性表达的PR1同源基因，其中，具有最高的启动子表达活性。PLACE在线预测发现其启动子区域含有大量的根特异表达相关顺式元件。对启动子进行截短试验，发现5′端截短片段L1、L2、L3、L4和L5均具有启动表达活性，长度为166 bp的L5（-166—-1）片段具有全长启动子80%的活性，并可驱动在转基因烟草根中特异表达；3个3′端截短片段R1、R2、R3和1个双端截短片段M1几乎检测不到GUS酶活性。p4XD-L5融合片段驱动在大豆发状根中超表达后可显著提高大豆发状根对疫霉菌的抗性，超表达发状根接种病原菌后发病程度和病斑长度显著低于对照，疫霉菌丝积累量在接种48 h时减少66.5%。在超表达组织中始终维持在高表达水平，在接种前，表达量是对照组织的39.2倍，接种后，表达量受疫霉菌侵染诱导进一步上调，并在36 h达到最高。在p4XD-L5::NDR1转基因本氏烟草根中的表达量显著高于茎和叶片，表现出明显的根部表达偏好性。超表达株系接种辣椒疫霉菌15 d后的株高、根长和鲜重显著高于对照，同时叶片萎蔫率和病斑长度显著低于对照植株。【结论】鉴定获得一个大豆根特异性表达启动子及其核心序列，融合诱导性和组织特异性启动子核心元件的人工启动子p4XD-L5驱动抗性基因超表达，可显著增强转基因大豆发状根和本氏烟草对疫霉菌的抗病性。

大豆（）；根特异性启动子；；人工启动子；根腐病抗性

0 引言

【研究意义】大豆是植物蛋白最佳来源之一，也是全球重要的油料和经济作物。在大豆生产过程中，由土传病原菌引起的大豆根部病害是严重危害大豆生产的世界性病害。其中，由大豆疫霉菌引起的疫霉根腐病已成为世界大豆生产中的第二大病害，每年造成10亿—20亿美元的损失[1]。将作物天然抗病基因、人工设计广谱持久的免疫受体蛋白以及优化整合不同类型的作物抗病基因导入目的作物，通过激发和强化作物自身免疫实现作物广谱持久抗病是转基因抗病育种的重要目标[2-3]。但植物的免疫与生长发育往往相互拮抗，同时抗病基因在目的植物中的非特异性表达往往存在适合度代价（fitness cost）的问题[4-5]。此外，外源基因在转基因作物收获器官的表达也会引起公众对于转基因产品安全性的担忧。如何确保作物免疫与其他农艺性状的协同调控，精准调控抗病基因在转基因作物中的时空表达模式，是植物抗病转基因育种的一个重要环节[3]。挖掘大豆根特异性启动子并鉴定其核心调控元件；进而通过人工设计的手段构建根特异性且受疫霉菌诱导表达的人工启动子，使抗病基因在高度可控的方式下驱动目的基因的表达，为转基因技术在大豆抗病育种中的运用提供了新的思路，并进一步提高抗病基因在转基因抗病育种中的利用价值。【前人研究进展】启动子是调控基因表达的关键元件，其序列包含众多顺式调控元件，通过调控基因在时间和空间上的有序表达确保植物正常的生长发育和生命周期[6-7]。根据顺式调控元件的表达特征，启动子可以分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子3种类型。作为植物遗传操作的重要组成元件，目前，使用最多的是组成型启动子，例如来自花椰菜花叶病毒的35S（CaMV35s）启动子、水稻的Actin启动子和玉米的Ubiquitin启动子[8]。采用组成型超表达抗性基因的方式虽然使转基因作物抗病性得到提高，但往往是在损失作物正常生长、发育和产量的前提下实现的，通过基因工程手段精确控制转基因表达是提高植物抗病的关键[5]。将拟南芥胁迫诱导基因启动子融合转录因子基因，导入烟草可以提高转基因植株对干旱及低温的抗性，同时，在正常生长条件下能够显著缓解由超表达引起的生长迟缓[9]。利用拟南芥根冠特异性表达的启动子驱动线虫杀虫肽在拟南芥和马铃薯中超表达，显著增强了转基因株系对甜菜胞囊线虫和马铃薯胞囊线虫的抗性[10]。启动子在限制杀虫肽组成型表达的同时维持甚至提高了转基因植物对胞囊线虫的抗性。以上研究表明，病原诱导型或组织特异性启动子在转基因育种中具有巨大应用潜力。目前，从多种植物中分离获得的根特异性启动子被证明能够驱动目的基因在转基因植物根中特异表达[8, 11]。大豆根特异性启动子及疫霉菌特异诱导表达启动子也有报道，和启动子能够驱动在模式植物拟南芥根中特异表达[12-13]。人工合成启动子122 bp片段的四重复单元，在烟草叶片中能够响应疫霉菌侵染并驱动触发细胞死亡[14]。【本研究切入点】目前，与其他作物相比，大豆根特异性启动子及其核心启动元件的研究仍有待深入，而组织特异性和诱导性启动子在大豆抗疫霉根腐病中的应用鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究拟通过分析大豆幼苗期根、茎和叶片组织中基因表达水平，筛选根特异性启动子并鉴定核心调控元件。进一步通过融合根特异性和疫霉菌诱导型启动子核心元件构建人工启动子并驱动抗性基因在大豆发状根和本氏烟草中超表达，评价转基因材料对病原菌的抗性，探讨组织特异性、诱导型启动子在转基因大豆抗病育种中的利用潜力。

1 材料与方法

1.1 材料及培养条件

大豆Williams和本氏烟（）种子均由江苏省农业科学院经济作物研究所豆类研究室保存。组培室及培养室均设置25℃，16 h光照/8 h黑暗光周期培养条件。大豆疫霉菌株P6497和辣椒疫霉菌株Pc35在25℃生化培养箱中培养。

1.2 序列比对及启动子顺式元件分析

从大豆基因组数据库（Wm82.a4）中分别提取、、、、和转录起始位点上游1 500 bp启动子序列。利用PLACE在线数据库（https://www.dna.affrc.go.jp/ PLACE/?action= newplace）预测启动子顺式调控元件，利用TBtools软件对根部特异表达相关元件在启动子上的分布进行可视化分析[15]。

1.3 基因组织特异性表达分析

收集生长3周龄大豆Williams幼苗根、茎和叶片组织样品，采用RNAsimple Total RNA Kit试剂盒（天根，北京）提取不同组织样品总RNA，采用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（Vazyme，南京）去除基因组和反转录，按照说明书操作获得各组织cDNA。选择6个候选基因的保守区段，利用Primer6软件设计RT-PCR引物，扩增片段大小为450 bp（RT- GmPR1-9-F：5′-GCCTACGCTCAAGATTCA-3′；RT- GmPR1-9-R：5′-CAGTTTGTAGGGTCTTTCAC-3′）。大豆作为内参基因（GmACT11-F：5′-GGTG GTTCTATCTTGGCATC-3′；GmACT11-R：5′-CTTTC GCTTCAATAACCCTA-3′）。利用RT-PCR方法分析组织表达特异性。

1.4 启动子克隆和载体构建

根据的1 500 bp启动子序列，设计启动子扩增引物（GmPR1-9-F：5′-gacctgcaggcatgcTTATCTGTGTGTCTGTGCTAAATAAATCA-3′；GmPR1-9-R：5′-ttaccctcagatctaTATATTAATTA TGCTTAATAGTATCACTTTCTTTAGC-3′），上、下游引物5′端分别含有pCAMBIA3301-GFP载体dⅢ和Ⅰ酶切位点同源臂序列。启动子序列经纯化后与线性化处理后的pCAMBIA3301-GFP进行同源重组反应（ClonExpress II One Step Cloning Kit，Vazyme，南京），转化后挑取阳性克隆送南京擎科生物公司测序。截短载体构建与启动子全长载体构建采用相同策略，与融合，与pCAMBIA3301-GFP载体连接，3′端引入mini35s小启动子。所构载体经验证后转入发根农杆菌K599，用于大豆发状根转化。

人工启动子p4XD-L5由南京擎科生物公司合成。PCR扩增获得包含同源臂的p4XD-L5启动子序列及序列[16]，并与经dⅢ、HⅠ双酶切的pCAMBIA3300-GFP同源重组构建pCAMBIA3300- GFP-p4XD-L5::NDR1。该载体分别转入K599和EHA105，用于大豆发状根及烟草稳定转化。

1.5 大豆发状根及烟草稳定转化

参考Yan等[17]方法，利用培养5 d的大豆子叶作为外植体诱导产生发状根。待发状根长出约3 cm时，用体视荧光显微镜筛选GFP阳性发状根，切下，转接到新鲜White培养基上继代培养1周，切取根尖部位进行GUS染色分析，剩余组织材料液氮速冻后-70℃保存，用于GUS酶活性检测。

采用农杆菌介导的叶盘法构建烟草转基因材料，并收获T0植株种子[18]。T1转基因幼苗经50 mg·L-1草铵膦抗性筛选及荧光筛选后，移栽至营养土中继续生长，并收集T2转基因种子。

1.6 GUS染色及酶活性检测

收集萌发10 d（MS培养基）且经荧光和草铵膦抗性筛选后的T2转基因烟草幼苗和发状根组织，用GUS染色液（50 mmol·L-1磷酸缓冲液、0.1%（v/v）Triton·X-100、2 mmol·L-1K4[Fe(CN)6]·3H2O、2 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]、10 mmol·L-1EDTA和2 mmol·L-1X-Gluc，pH7.0）37℃黑暗孵育12 h。然后，用70%酒精隔水加热脱色处理直至背景无色，拍照记录。

将大豆发状根组织用液氮研磨成粉末，利用定量检测试剂盒（Coolaber，北京）和Bradford蛋白浓度测定试剂盒（Coolaber，北京）进行蛋白提取、浓度测定、标准溶液及反应液配制。反应结束后，在激发光365 nm发射光455 nm条件下检测荧光信号值。GUS酶活以每微克蛋白在单位时间（min）中生成4-MU的量（pmol）表示。

1.7 转基因材料抗病性分析

采取以下2种方案接种大豆发状根：（1）菌丝块接种。从新鲜培养4 d大豆疫霉P6497菌丝边缘切取3 mm3大小菌丝块接种在发状根伸长区，在接种24和48 h后测量病斑长度。（2）游动孢子液接种。从培养4d大豆疫霉菌丝边缘用无菌手术刀切割2 mm3菌丝块接种液体V8培养基中，25℃暗培养3 d。清洗菌丝3—4遍，至菌丝呈白色，加入少量灭菌自来水后继续培养24 h，即有大量游动孢子释放。过滤收集游动孢子，并稀释至1×104个/mL备用。选择生长状态一致的发状根幼嫩部位组织，浸泡在含有5 mL游动孢子液的离心管中。在接种后0、12、24、36和48 h收集样品，利用qRT-PCR方法检测组织中的表达水平和疫霉菌的相对生物量。疫霉菌相对生物量以疫霉菌内参基因积累水平与大豆内参基因积累水平的比值来衡量。

选择生长6周龄且生长状态一致的WT（野生型烟草植株）、EV（转空载体植株）和3个p4XD-L5:: NDR1超表达本氏烟植株，紧靠烟草植株茎基部戳一个1 cm深的小洞，滴加1 mL（1×104个/mL）辣椒疫霉Pc35菌株游动孢子液。在接种0、5和10 d后拍照记录发病表型，并在15 d统计接种植株地上茎上的病斑长度、叶片萎蔫比例、株高、主根长和植株鲜重指标。

2 结果

2.1 大豆根特异表达基因筛选及启动子分析

从转录组数据中发现6个根特异性表达的病程相关蛋白（pathogenesis-related protein 1）基因：（）、（）、（）、（）、（）和（）（图1-A）。其中，至位于第13染色体的同一基因座内，为串联重复的同一家族基因；位于第15染色体。转录组表达分析显示在根中表达水平最高（图1-A），并且仅在根中检测到基因表达（图1-B）。

PLACE预测结果显示，6个PR1基因启动子区均含有大量根特异表达相关的作用元件：MYCCONSENSUSAT、OSE1ROOTNODULE、OSE2ROOTNODULE、RAV1AAT、ROOTMOTIFTAPOX1、SP8BFIBSP8AIB和SP8BFIBSP8BIB[19]。其中，包含最多的是MYCCONSENSUSAT和ROOTMOTIFTAPOX1（图2）。前期试验证明，启动子在大豆发状根中具有更强的驱动活性，因此，选择该基因进行后续研究。

A：GmPR1-9及其同源基因的表达热图（log10FPKM）；B：GmPR1-9的RT-PCR分析

2.2 根特异性表达核心调控元件的筛选

为了挖掘启动子核心调控元件，根据根特异性相关元件的位置，构建系列启动子截短载体（图3）。通过对转基因发状根进行GUS组织化学染色，结果表明，启动子-405—-1 bp序列足以驱动表达。基于此，位于-405—-311（95 bp）、-310—-171（140 bp）、-166—-1（166 bp）的启动子片段均能驱动表达。GUS酶活性检测结果表明，启动子全长与L1片段（-1 253—-1 bp）启动活性相当；166 bp启动子片段（L5）驱动活性为全长启动子活性的80%；3个3′端缺失片段R1（-1 500—-171 bp）、R2（-1 500—-406 bp）、R3（-1 500—-1 254 bp）和1个双端缺失片段M1（-1 253—-406 bp）几乎检测不到GUS酶活性（图3和图4）。以上结果说明，位于3′端的166 bp启动子序列（L5）对于驱动在大豆发状根中表达具有重要功能，该片段启动子含有1个ROOTMOTIFTAPOX1和1个SP8BFIBSP8BIB顺式元件（图2）。

图2 启动子序列中根部特异表达相关的顺式作用元件分布

A：pGmPR1-9启动子截短示意图。L1—M1：启动子截短位置信息；B：转基因发状根GUS组织化学染色

不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。下同 Different letters indicate significant differences (P<0.05). The same as below

为进一步验证L5启动子片段的根特异表达活性，将L5启动子融合并导入本氏烟草植株。T2转基因烟草种子在含有草铵膦的MS培养基上萌发并经GFP荧光筛选（图5-A）。对生长10 d的阳性植株进行GUS组织化学染色，结果显示，转基因烟草根部均被染成蓝色，而在叶片和茎中观察不到蓝色（图5-B—图5-E）。表明L5片段能够驱动在烟草根部特异性表达。

2.3 p4XD-L5::NDR1超表达增强大豆发状根对疫霉菌的抗性

为进一步确保L5片段能高水平启动转录，在5′端融合488 bp的4XD疫霉菌诱导表达核心元件[14]，构建人工启动子p4XD-L5，以确保驱动目的基因在感受病原菌侵染时的高水平表达。通过该启动子驱动大豆疫霉菌抗性基因在大豆发状根中超表达，比较转基因组织对大豆疫霉菌的抗性水平，从而评价根特异性启动子L5在植物抗病中的应用价值。结果显示，在接种24 h后，对照发状根出现明显病斑，菌丝在接种点迅速积累并沿根表面向两侧扩展；接种48 h后，褐色病斑进一步扩展并出现水渍，菌丝在病斑区域大量积累（图6-A）。p4XD-L5::NDR1转基因根发病程度显著低于对照，病斑长度也显著小于对照（图6-A和图6-B）。p4XD-L5::NDR1转基因根中的疫霉菌丝积累量在接种后的4个时间点均显著低于对照组织，在接种48 h时，疫霉菌丝积累量与对照相比减少66.5%（图6-C）。接种后表达量检测结果表明，对照组织中在接种后上调表达并在48 h达到最高值（图6-D）。而在p4XD-L5::NDR1转基因发状根中，始终维持在高表达水平。在接种前的表达量是对照组织的39.2倍，接种后表达量进一步提高并在36 h达到最高水平；接种48 h表达量略微降低，但仍是对照组织中表达量的22.5倍。以上结果说明，人工构建的p4XD-L5启动子能够驱动在大豆发状根中表达且保持病原菌诱导表达特性，并增强转基因根组织对疫霉菌的抗性。

A：转基因烟草种子荧光筛选；B—E：10 d转基因烟草幼苗、叶片、茎和根的GUS组织化学染色，bar=1 mm

A：发状根接种大豆疫霉菌丝块的病斑表型；B：病斑长度统计；C：大豆发状根组织中疫霉菌相对生物量积累；D：大豆发状根组织中GmNDR1的相对表达量。EV表示空载体对照。**表示处理间差异极显著（P<0.01）。下同

2.4 p4XD-L5::NDR1超表达增强烟草对疫霉菌的抗性

为了从整株水平评价p4XD-L5::NDR1在植物对疫霉菌抗性中的功能，将p4XD-L5::NDR1转入本氏烟草，并获得T2转基因株系。p4XD-L5驱动目的基因在根中表达量显著高于茎和叶片（图7）。WT、EV和3个p4XD-L5::NDR1转基因株系接种5 d后均出现不同程度的萎蔫，但3个p4XD- L5::NDR1转基因株系仅底部叶片发生萎蔫，且植株高度受影响较小（图8-A和图8-B）。接种10 d后，WT和EV植株出现明显矮化、叶片萎蔫黄化，而3个p4XD-L5::NDR1转基因株系发病表型明显较轻，株高显著高于对照（图8-C和图9-A），萎蔫叶片比例显著降低（图8-C和图9-B）。p4XD-L5::NDR1转基因株系茎基部病斑长度显著小于对照接种植株（图8-D和图9-C）。此外，4XD-L5::NDR1转基因株系主根长显著大于对照植株（图8-E和图9-D），且植株鲜重高于对照（图9-E）。以上结果表明，p4XD-L5::NDR1转基因株系对辣椒疫霉菌的抗性显著提高。

图7 GmNDR1在转基因烟草根、茎和叶片中的表达量

A—C：辣椒疫霉菌株Pc35游动孢子接种烟草0、5和10 d后整株表型；D—E：接种10 d后烟草茎基部和根系组织的病斑表型

A：株高；B：叶片萎蔫比例；C：病斑长度；D：主根长；E：植株鲜重

3 讨论

3.1 pGmPR1-9是一个大豆根特异性启动子

根特异性启动子的挖掘及核心调控元件的鉴定，对于利用基因工程手段改良作物养分吸收、干旱及盐碱等非生物胁迫和根部病虫害等生物胁迫抗性具有重要意义[20-21]。目前，在水稻、烟草、马铃薯、番茄、大豆等作物中鉴定到一批根特异性启动子，但其在作物遗传改良中的应用还缺乏深入的研究[22-24]。本研究通过分析大豆幼苗期根、茎和叶片转录组数据，发现6个具有根特异表达特性的PR1同源基因。PR基因家族作为植物抗病研究中的一个明星基因，其表达强烈受到如卵菌、真菌、细菌、病毒侵染及昆虫取食诱导。PR基因是一个包含17个家族成员的基因家族，其中PR1家族蛋白是一个富含半胱氨酸的分泌蛋白，其核心区域在不同物种中相对保守[25]。

在大豆中，通过对已公布的大豆转录组进行分析，发现24个PR1家族成员广泛受到生物和非生物胁迫诱导表达，其组织表达特异性也存在多样性[26]。PR基因的组织特异性在植物不同发育时期也存在差异，高丽参在3周龄幼苗期具有明显的根表达偏好性，而在2年期植株体内则表现出叶片表达特异性[27]。豌豆中一个PR同源基因表现出根表皮及幼胚表达特异性[28]。小麦和均表现出强烈的根表达特异性，但是在叶片接种白粉菌后和的表达量受病原菌侵染诱导不断升高[29]。拟南芥中属于PR-5家族的类甜蛋白基因在受荧光假单胞诱导后在根维管组织中特异表达[30]。大豆则具有明显的叶片表达偏好性[31]。以上研究表明PR基因组织特异性并非一成不变的，在本底表达水平极低的组织中，由于启动子上病原诱导等顺式调控元件的调控而表现出诱导表达特性。

本研究6个PR1基因启动子区域均含有大量与调节根特异性表达相关的顺式元件，通过截短试验获得具有全长启动子80%活性的启动子片段L5（166 bp）。转基因试验证明L5片段能够驱动在转基因烟草根部特异性表达，说明L5片段上的ROOTMOTIFTAPOX1和SP8BFIBSP8BIB调控元件对于驱动目的基因在根中特异性表达起着重要功能。前人报道将4拷贝的根特异性顺式作用元件OSE1ROOTNODULE、OSE2ROOTNODULE、SP8BFIBSP8AIB和ROOTMOTIFAPOX1以串联排列方式设计合成的根特异性模块能够驱动在转基因烟草根中特异性表达[32]。本研究结果表明仅含有单拷贝ROOTMOTIFTAPOX1和SP8BFIBSP8BIB作用元件的更短序列仍在转基因植株中赋予目的基因根特异表达特性。

3.2 植物时空调控启动子在作物遗传改良中的应用

外源基因的组成型高表达通常会产生多种不良效应。例如，超表达调控次生壁形成的转录因子基因和会引起薄壁细胞中的异位次生壁增厚，从而导致转基因植物严重矮化[33-34]。因此，需要确保启动子能够在高度可控的方式下驱动目的基因的表达，以达到既能避免不良性状的产生，又能在特定的组织或发育阶段获得目标性状的目的。最近一个利用启动子精确地修改作物性状的例子是对水稻启动子的研究，IPA启动子一段54 bp关键顺式作用元件的缺失使突变体表现出穗重和穗粒数同时增加、株高变高、茎秆和根系粗壮，实现了不同表型的特异性调控，从而打破了产量因素之间的负效应[35]。

由土传病原菌引起的大豆根部病害是严重危害大豆生产的世界性病害。由于根部侵染的特性，在田间发生肉眼可辨病症的时候往往已经处于发病后期，此时进行农药防治难以取得预期效果[36]。因此，通过基因工程手段构建仅在根中特异表达抗病基因的转基因品种是一种有前途的改良策略。本研究p4XD-L5不仅能够驱动在根中高水平表达，而且保持受病原菌诱导上调表达的能力，从而增强了转基因大豆发状根组织和烟草植株对病原菌的抗性。在烟草中，没有发现转基因植株与对照植株之间存在生长速度及株型上的明显差异，但在转基因烟草株系茎和叶片中均检测到低水平的表达，说明4XD病原诱导启动元件在其他器官中仍具有部分表达活性。通过研究不同调控元件排列顺序对表达特异性的影响，降低病原诱导启动元件在非目的器官中的表达水平仍需要进一步的研究。此外，在转基因大豆中，该策略是否对农艺性状产生不良影响还需要进一步的大豆稳定转化验证，并且需要选择更多的抗性基因进行评价。虽然如此，本研究为通过基因工程手段培育大豆抗疫霉根腐病品种进行了有益探索，提出一个精准调控抗性基因表达的可行思路。

4 结论

大豆是一个根特异性启动子，166 bp长度的L5片段为控制根特异表达的关键片段。融合诱导性和根特异性核心元件的人工启动子p4XD-L5能够驱动目的基因在根中高效表达，该人工启动子可作为转基因大豆根腐病改良中调控转基因时空特异表达的候选遗传操作元件。

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2023年全国畜牧兽医期刊征订目录

序号期刊名称邮发代号刊期年定价/元联系人电话地址邮编E-mail 16饲料博览14-184双月刊90.00 倪树森0451-55190639黑龙江省哈尔滨市香坊区东北农业大学内150030slbl@vip.163.com 17兽医导刊（上半月）80-328半月刊150.00 赵晓13520538616北京市朝阳区麦子店街20号农业农村部北办公区001室100125sydk2007@263.net 18经济动物学报自办发行季刊100.00 刘兆娟0431-84533130 吉林省长春市新城大街2888号吉林农业大学130118jjdwxb@163.com 19广东饲料自办发行月刊120.00 周风珍020-37288820广东省广州市天河区先烈东路135号4号楼609室510500gdfeed@vip.163.com 20Journal of Animal Science and Biotechnology自办发行双月刊600.00 刘萍010-62734403北京市海淀区圆明园西路2号中国农业大学动物科技学院154室100193jasbeditor@gmail.com 21中国兽医科学54-33月刊180.00 张文举0931-8342195 0931-8310086甘肃省兰州市盐场堡徐家坪1号730046zgsykx@zgsykx.com 22中国兽医杂志2-137月刊240.00 黄长钦010-62733040北京市海淀区圆明园西路2号中国农大动物医学院100193vetzzhi@cau.edu.cn 23中国乳业82-764月刊240.00 张爱华010-82106274北京市海淀区中关村南大街12号100081zhgry@caas.cn 24中国猪业80-493双月刊180.00 张爱华010-82106274北京市海淀区中关村南大街12号100081zhuye@caas.cn 25中国牛业科学52-113双月刊72.00 张琪029-87091423陕西杨凌西北农林科技大学动物科技学院712100Huangn2002813@aliyun.com 26动物医学进展52-60月刊180.00 黄建文029-87092574陕西杨凌西北农林科技大学动物医学院712100dyjzyilan@263.net 27家畜生态学报52-112月刊72.00 陈小强029-87091130陕西杨凌西北农林科技大学动物科技学院712100jcst@x263.net 28畜牧产业82-612月刊180.00 黄伟010-62123852北京市海淀区中关村南大街12号农科院饲料所辅助楼504100081xmcy@caaa.cn 29畜牧与饲料科学16-101双月刊90.00 赵俊利0471-5294608内蒙古呼和浩特市昭君路22号内蒙古农牧业科学院010031cnmxky@vip.163.com

Identification of the root-specific soybeanpromoter and application inroot-rot resistance

YAN Qiang, XUE Dong, HU YaQun, ZHOU YanYan, WEI YaWen, YUAN XingXing, CHEN Xin

Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014

【Objective】The objective of this study is to identify the root-specific promotors and the core regulatory sequence of soybean. Then evaluate the potential application of the synthetic promoter inroot-rot resistance.【Method】The genes which specifically expressed in roots with high expression levels were screened based on the transcriptome date of soybean root, stem and leaf tissues in the seedling stage. Based on the distribution of theelements, the promoter truncation approach was used to map the minimal promoter controlling root specific expression in soybean hairy roots. The obtained minimal promoter fragment was concatenated with theinducible promoter elements p4XD to construct the synthetic promoter. The synthetic promoter driven over-expression ofresistance related genein soybean hairy roots, then the resistance level of transgenic tissue toand the expression profiles ofduring the interaction had been analyzed. Furthermore, the transgenicplants were generated to evaluate the resistance at plant level. 【Result】Though screening, six soybean PR1 homologues with significant root specific expression manner were identified, andhad the highest promoter activity. Numbers of root specific expression relatedelements were identified in promoter sequence using the online tool PLACE. Truncation analysis of the promoter showed that serial 5’ end deletions L1, L2, L3, L4 and L5 had different GUS activities. The L5 (-166 to -1) fragment had 80% activity of the full-length promoter, and was able to driveexpression in roots of transgenic. GUS enzyme activity was almost undetectable in three 3’ end deletions R1, R2 and R3, and the double terminal deletion mutant M1. When the fusion promoter p4XD-L5 drivenexpression in soybean hairy roots, the resistance towas significantly enhanced. The disease severity and lesion length were significantly reduced in the over-expression hairy roots when compared with control, and the relative biomass of Phytophthora decreased by 66.5% at 48 h post inoculation.maintained high expression level in over-expression tissues, with 39.2 times of that in control tissues. The expressions were further up-regulated after inoculation, and reached the highest level at 36 h. In p4XD-L5::NDR1 transgenicplants, the expression ofwas significantly higher in roots than that in stems and leaves. Fifteen days afterinoculation, the plant height, root length and fresh weight ofover-expression plants were significantly higher, and meanwhile the leaf wilting rate and lesion length were significantly lower. 【Conclusion】This study obtained a soybean root specific promoter and identified the core regulation sequence. The strategy which driven the expression ofby the synthetic promoter p4XD-L5 combined theinducible and tissue-specific promoter core elements can significantly enhance the resistance of transgenic soybean hairy roots andplantstopathogens.

soybean (); root specific promotor;; synthetic promoter;root-rot resistance