李永峰， 王克华， 窦套存， 胡玉萍， 郭 军， 王星果， 马 猛， 曲 亮

(江苏省家禽科学研究所，江苏扬州 225125)

饲料成本是蛋鸡饲养成本主要组成部分，通过提高饲料效率可有效降低饲养成本，优化饲料配方是提高饲料效率的重要手段。然而，随着生物技术的发展，基因选择成为一种更有效的方法[1]。肠道发育是家禽饲料效率的重要影响因素之一，与消化酶的活性和营养吸收能力息息相关[2]。肠道质量是反映肠道发育的重要指标。目前，关于鸡小肠质量遗传背景的研究很少，有必要对其遗传结构进行解析。GWAS通过对全基因组中的序列变异、表型和系谱信息进行关联分析，从而筛选出目标性状的调控基因或元件[3]。与传统QTL定位作图方法相比，GWAS检测变异的效果更好，定位的基因组区域更窄[4]。在鸡的形态特征、生产性状、抗病等方面已有许多GWAS研究成果[3]，但与鸡小肠质量有关的GWAS研究鲜有报道。本研究选取F2代资源群体母鸡1 512羽，采用600K鸡SNP芯片进行基因型检测和GWAS分析，以期为蛋鸡小肠质量性状的遗传机制解析提供参考，为分子育种提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 资源群体构建

由白来航(WL)纯系和东乡绿壳蛋鸡(DX)纯系杂交生产F2代资源群体，由图1可知，最终获得F2代个体母鸡1 893羽，从中选择1 534羽用于SNP基因型检测。试验时间为2012—2014年，试验地点为江苏省家禽科学研究所扬州翔龙禽业有限公司。

1.2 表型测定

屠宰72周龄F2代鸡，收集十二指肠、空肠和回肠，挤压出内容物后称质量记录。使用SAS进行描述性统计分析，所有数据经正态转换后用于GWAS和遗传估计等下游分析。

1.3 基因分型、质量控制

鸡翅静脉采血收集F2代母鸡血液，血液DNA使用苯酚/氯仿萃取法抽提，选用600K Affymetrix Axiom鸡高密度基因芯片进行基因型检测，通过Affymetrix工具v1.16.0软件执行质量控制(QC)，保留QC≥0.82样品，获得有效样本1 512个，有效SNP 532 299个。本统计方法对表型和性染色体基因型的关联检测低于常染色体，因此删除性染色体上所有SNP。使用PLINK v1.90软件包做进一步质量控制[5]，剔除次等位基因频率<0.05、偏离哈迪温伯格检验(P<10-6)的SNP。基因型填充分析由BEAGLE v4.0[6]程序执行，保留质量分数(R2>0.5)的SNP，最终获得1 512羽个体和435 867个SNP。

1.4 全基因组关联分析

为消除虚假关联，首先使用PLINK软件包进行主成分分析。利用simpleM[7]法计算全基因组显著性和潜在性关联的阈值。有效独立测试值为 59 308，因此全基因组显著性P值为8.43×10-7(0.05/59 308)，潜在性P值为1.69×10-5(1.00/59 308)。使用GEMMA v0.94软件[8]中的单变量混合模型对小肠质量性状进行GWAS，模型公式如下：

y=wα+xβ+μ+ε；

其中：y是n个个体的n×1表型值向量；w为固定效应，是n×c协变量矩阵，包括列向量1；α是c×1相应系数向量，包括截距；x是测试位点的n×1标记基因型向量；β表示每个标记中次等位基因的效应，是标记的效应大小；μ是n×1随机效应向量，协方差结构为μ-N(0，KVg)，其中K表示n×n遗传相关矩阵，来源于SNP标记，Vg是多基因加性方差；ε是ε～N(0，IVe)的n×1随机残差的向量，I是n×n单位矩阵，Ve是残差方差分量。

使用R软件GAP包绘制曼哈顿和quantile-quantile(QQ)图，GenABEL包中的estlambda函数计算基因组膨胀因素λ(表示假阳性信号程度)[9]。

1.5 遗传力估计及对表型方差贡献率

使用REML法估计遗传力，由GCTA v1.24程序执行[10]。使用二元混合模型估计各部分肠质量遗传和表型相关[11]。估计全基因组显著SNP、表型方差贡献的混合线性模型如下：

其中，y是表型向量；x是解释表型固定效应的关联矩阵；b是固定效应向量；zj是基因型协变量SNPj(AA=-10，AB=0，BB=+10)；αj是SNPj的等位基因替代效应；δj是参数，表示SNPj是否包含在马尔可夫链蒙特卡罗(MCMC)链；ε是与分析相关的误差。

1.6 基因鉴定

使用Biomart工具(基于Ensembl支持的Galgal4组件)和变异效应预测软件VEP鉴定显著位点的候选基因[12]，并检测给定基因组区域中的基因[13]。

2 结果与分析

2.1 表型和遗传参数

表1为十二指肠质量(DW)、空肠质量(JW)、回肠质量(IW)描述性统计结果。共测量 1 508 羽母鸡，获得十二指肠1 435个、空肠1 436个、回肠 1 434 个有效数据。3个性状的变异系数均较大，这可能是由于F2代资源群体的个体差异较大。

表1 F2代鸡小肠质量的描述性统计

通过合格的GWAS标记对计算DW、JW、IW的加性遗传方差，并统计遗传参数。由表2可知，单变量GCTA分析显示，3种肠道质量性状遗传力在中等水平，DW的遗传力估计值最高，为0.32。双变量GCTA分析表明，3种肠道质量性状表现出较高的遗传相关，JW与IW的遗传相关最高，为0.88。表型分析表明，3种小肠质量也具有中等程度表型相关。

表2 小肠质量遗传参数

2.2 候选位点GWAS鉴定

对3种小肠质量分别进行单变量全基因组关联分析，结果由表3、图2可知，分别有185、201、36个全基因组显著SNP位点与DW、JW、IW关联(共422个)。几乎所有的显著位点均位于1号染色体的166.6～173.2 Mb基因组区域，仅有1个显著SNP位点位于4号染色体的49.9 Mb基因组区域。由图2可知，共有28个显著SNP位点与3种小肠质量性状均显著相关。根据所有影响DW、JW、IW的SNP的P值制作曼哈顿图和QQ图(图3)。

表3 显著SNP位点数量和分布

2.3 显著位点的基因注释

基因内部的SNP比基因间区域的更重要。由表4可知，通过VEP和Biomart对3种小肠质量性状均显著的28个SNP周围区域进行扫描，鉴定与3种小肠质量相关的基因，发现有6个SNP位于4个基因的内含子区。rs313669574和rs313152047对应基因FOXO1，rs315029039对应基因CKAP2，rs313765223对应基因CAB39L，rs312737959和rs13972990对应基因MRPS31。将这6个SNP位点和4个基因作为候选位点和基因。

2.4 估计表型方差贡献率(CPV)

对上述6个SNP位点进行CPV计算，由表4可知，位点rs313669574、rs313152047、rs315029039、rs313765223、rs312737959和rs13972990可分别解释小肠质量表型方差的2.92%～3.26%、2.84%～4.80%、3.23%～3.71%、3.29%～5.33%、3.26%～4.99% 和3.29%～4.85%。

3 讨论

肠道作为重要的消化器官，其发育对动物的生长发育和生产性能有重要影响，有必要对肠道质量基因组结构进行。GWAS是研究动物遗传结构特点的有效手段，广泛应用于多种畜禽，如猪[14-15]、牛[16-17]和家禽[18-19]。因此，本研究对1 512羽F2代蛋鸡资源群体小肠质量进行GWAS分析，扩大性状差异化水平，提高差异性状QTL识别能力，并使用高密度SNP芯片覆盖鸡所有的染色体，从而提高结果的准确性和可靠性。

描述性统计结果可知，小肠质量的变异系数很大， 提示个体间性状差异化水平很高。遗传评估的结果表明，DW、JW、IW均具有中等遗传力。性状相关的分析结果表明，3个小肠质量性状具有较高的遗传相关性，但表型相关均处于中等水平，说明环境因素对小肠质量性状的影响较大。这与Li等关于小肠长度的研究结果[20]相似，二者的遗传特征相似。

GWAS的结果表明，DW、JW、IW的422个显著SNP位点中，有421个位于1号染色体的166.6～173.2 Mb区域，表明3个小肠质量的遗传控制高度集中。这与我们在小肠长度的研究结果相似，显著SNP位点集中在1号染色体的170 Mb区域[20]，表明肠道发育的遗传控制主要集中在1号染色体的170 Mb附近区域。

通过对DW、JW、IW均显著的28个SNP进行分析研究，有6个SNP(rs313669574、rs313152047、rs315029039、rs313765223、rs312737959和rs13972990)和对应的4个基因(FOXO1、CKAP2、CAB39L和MRPS31)被列为最重要的SNP位点和基因，因为这6个SNP位于相应基因的内含子区。Forkhead转录因子FOXO1(forkhead box O1)可能在肌源性生长和分化中起作用，是调节胰岛素靶组织中葡萄糖代谢和胰岛素反应的关键转录因子[21-22]。研究表明口服胰岛素可刺激IUGR仔猪小肠绒毛的生长和黏膜功能的成熟[23-24]，因此推测它在小肠发育中可能通过调节胰岛素起作用。CKAP2(cytoskeleton associated protein 2)是细胞骨架相关蛋白2，参与细胞的有丝分裂过程[25]。研究表明，CKAP2在视网膜微血管内皮细胞[26]和肝癌细胞[27]的增殖、迁移中发挥作用，并与卵泡发育和选择关系密切[28]，推测其可能与多器官的发育有关。CAB39L(calcium binding protein 39 like)作为MO25家族成员，编码钙结合蛋白39样。研究表明CAB39L能够通过AMPK途径调节食物的摄入[29-30]，且鸡体内也存在与哺乳动物相似的AMPK途径[31]。肠道发育也与动物的采食量有关，但其与CAB39L的关系还有待进一步研究。MRPS31(mitochondrial ribosomal protein S31)是线粒体核糖体蛋白S31，参与线粒体中蛋白质的合成，在各种生命活动中都起重要作用。综上所述，这4个基因可能与小肠重量高度相关，而其对应的6个SNP的CPV均较高，进一步说明它们可能是影响鸡小肠质量的重要候选基因。

表4 小肠质量性状全基因组关联分析

4 结论

通过GWAS共鉴定出28个与DW、JW、IW均显著相关的SNP，全部集中在1号染色体的166.6～173.2 Mb区域，其中6个SNP位于相应4个基因的内含子区，这些位点和基因可能是影响小肠质量的重要SNP位点和基因。