贺会利，谢永平*，庞彬辉，曾 飞

1.广西兽医研究所，南宁 530001；2.广西兽医生物技术重点实验室，南宁 530001；3.广西桂东公司，广西 梧州 543100

灵长类试验动物是生命科学研究中的“活的试剂”，是人类健康与安全的“活的屏障”，是应用于人体之前的“最后一道防线”。灵长类试验动物包括食蟹猴、猕猴等，经过长期试验对比后发现，食蟹猴的大脑结构、生理功能、免疫系统以及基因与人类相似，且繁殖较快，体型较小，因此成为基础医学和应用生物医学研究中使用最广泛的灵长类动物模型[1]。中国养殖的试验猴以食蟹猴为主，约占产业总量的80%～85%，广西地理气候条件最适宜人工繁殖食蟹猴，是全国最大的食蟹猴养殖地区。2020 年突如其来的新冠肺炎疫情让全球都面临缺少食蟹猴做疫苗动物试验的严峻问题，同时一些国家限制了食蟹猴的出口，导致试验动物的数量不断减少，这些因素加速了广西食蟹猴养殖业的发展[2]。随着试验猴集约化养殖程度的提高，各类危害试验猴的疾病也不断增加，寄生虫（如结肠小袋纤毛虫）引起的食蟹猴疾病问题尤为突出[3-6]。

1 检测方法

1.1 直接涂片法

在载玻片上滴加1 滴生理盐水，用竹签挑取少许新鲜粪便在生理盐水中涂抹均匀，加盖玻片后置光学显微镜下观察。

1.2 水洗沉淀集卵法

取被检粪便10～15 g，加水20～30 mL 搅拌成混悬液，用孔径0.25 mm 的铜筛过滤到100 mL 的三角烧杯中，置于10 mL 离心管，3 000 r/min 离心5 min，弃上清，留下沉淀物。向沉淀物加入蒸馏水充分搅拌混匀，静置30 min，倒去上清液，沉渣再加入蒸馏水，调匀，静置30 min。重复3～4 次，直至上层液变清。最后倒去上清液，取沉渣涂片镜检。

1.3 卢氏碘液染色法

用吸管吸取量杯底部沉淀物1 滴，加卢氏碘液工作液1 滴，搅匀，盖上盖玻片后，在10×和40×光学显微镜下测量观察。

1.4 分子生物学检测技术

运用贺会利等[7]建立的PCR 技术，以及根据GenBank 中已经发表的结肠小袋纤毛虫18S rRNA序列，利用在线软件http://primerexplorer.jp/e/设计引物建立LAMP 检测技术（表1）。按照粪便基因组DNA 提取试剂盒说明进行样品DNA 提取，以此DNA 为模板，应用上述LAMP 引物进行扩增，其体系（25 μL）如下：2×反应缓冲液12.5 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，引物各1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O5.5 μL，总反应体系25 μL。瞬时离心混匀，用loopamp R实时浊度仪LA-320c 在63 ℃条件下对样品进行扩增。

表1 LAMP 引物信息

2 防控措施

2.1 日常饲养管理

由于部分肠道寄生虫直接利用水、土壤及食物进行传播，因此对于圈养的试验猴，防治结肠小袋纤毛虫病最根本的措施就是对其生活环境进行定期寄生虫杀灭，对养殖场的水源、饲料等进行严格的管理，最大限度地确保可以摄取到干净的水源、青料等；饲养人员可以按照一定的比例在饲料中添加多种维生素，或者也可以在饮水中添加口服补液盐，提升试验动物的抵抗力。饲养人员要每天及时清除动物粪便，并进行无害化处理，保持动物栏舍卫生。同时提高对结肠小袋纤毛虫病危害的认识，增强公共卫生意识，定期对养殖场工作人员进行体检，保障饲养人员、兽医工作者及相关密切接触人群的身体健康，避免人猴相互传播。严禁在养殖场饲养猫和犬等其他动物，以免相互传播疾病。根据结肠小袋纤毛虫病发病季节及流行特点，制订科学合理的防治措施。每年春、秋两季进行全场检测，并进行预防性驱虫。引种时必须对试验猴进行逐只检测各类寄生虫及其他传染病，并作隔离检验，防止病原传入。经隔离检验确认健康后方可合群，避免结肠小袋纤毛虫病的再次发生。加强疫情监测，做到早发现、早隔离、早治疗。

2.2 药物治疗

对于确诊的试验动物首先进行隔离治疗，选择敏感药物进行治疗。

1）隔离治疗：根据检测结果，将发病严重的猴和检测阳性的猴只进行隔离治疗，以便单独护理，灌服甲硝唑、阿苯达唑片或自行研发的中药驱虫药剂等敏感药物；对腹泻严重的猴只同时喂给电解质多维，以便调节猴体电解质平衡，防止因腹泻脱水导致酸中毒。药物治疗5～7 d，病情好转后停药5 d，取样检测阴性后继续观察，定期检测，治愈后反复3 次检测均为阴性，健康后方可合群。

2）群体治疗：应用甲硝唑、阿苯达唑片或中药驱虫药按比例与饲料混合饲喂全群猴，连用5 d，停药5 d 后，取样检测阴性后继续观察，定期检测。

3 讨 论

3.1 结肠小袋纤毛虫的特征及流行概况

长期以来，人们对灵长类试验动物具有致病性的细菌和病毒研究较为重视，但对具有高度传染性及致病性的肠道寄生虫研究报道较少[8]。由寄生虫感染引起的寄生虫病一直是全球，特别是发展中国家普遍存在的公共卫生问题，不仅阻碍经济发展，而且对人类的健康也造成了严重危害，目前尚无有效的寄生虫病疫苗[9]。研究试验猴的发病情况表明，寄生虫引起的消化系统疾病所占比例最大，结肠小袋纤毛虫的感染率极高[10]。结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli，B.coli) 的整个发育的过程会有滋养体和包囊2 种阶段。滋养体主要以横二分裂法增殖，滋养体形态呈椭圆形或梨形，无色透明或淡灰略带绿色，具有细胞口，全身披有短而整齐的纤毛，可借纤毛的摆动迅速旋转前进，活虫体极易变形，在不利的环境中形成包囊，包囊不易受环境压力影响，可以在10%的福尔马林中存活10 h 以上[11]，具有很强的感染能力，是病原体的传播阶段。目前已知的可感染包括人在内的33 种动物，如猪、猩猩、猴、马、羊等均可感染，主要通过吞食被包囊污染的水护着食物导致感染，猪是主要的传染源[12]。我国已有20 多个省市出现结肠小袋纤毛虫感染，感染和分布有扩大的趋势。有研究发现试验猴结肠小袋纤毛虫的感染率为26.1%[13]。开放式的饲养条件下，试验动物胃肠道的寄生虫感染率更高。该种疾病主要危害幼猴，当饲养密度加大时，猴群感染各类寄生虫疾病的几率极大地增加，同时由于寄生虫具有一定的隐蔽性，当猴群身体抵抗能力较强时，发病症状不是很明显，在进行临床诊治中易出现误诊，错过最佳的防控时机，因此给动物带来的危害必须重视。

3.2 结肠小袋纤毛虫检测技术

准确而快速的诊断是防治寄生虫病的重要环节，可以最大程度降低危害。传统寄生虫检测包括形态学检测、免疫学检查等。形态学方法是寄生虫病诊断的“金标准”，采用显微镜或染色观察寄生虫虫体或虫卵等特有的形态及结构，诊断出感染的寄生虫种类，此方法对操作人员专业水平要求较高，常受杂质影响较大，检出率较低，对于大批量的样品检测，需要大量的人力物力，同时对操作人员身体健康影响较大，不适合寄生虫病在现场上的快速诊断。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接血凝试验（IHA）等免疫学检测方法，具有易出现假阴性和假阳性的结果、不能区分是现症感染还是既往感染、特异性和敏感性较差、不利于寄生虫病的准确检测、成本费用较高等缺点[14]。随着分子生物学检测技术的不断发展，以病原体特异性核酸片段为检测对象的方法更加简便精确，在寄生虫病的诊断方面有广阔的应用前景[15]。聚合酶链反应（PCR）具有灵敏度高、特异性强、操作简便、高效快捷等优点[16]，可做到实时监测，快速检测结肠小袋纤毛虫。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术具有操作简单、快速高效、高特异性、高灵敏度、低成本等优点，已被应用于血吸虫、弓形虫、球虫[17-19]等寄生虫的研究中，LAMP 技术是目前比较先进的检测方法，目前已应用于实验室研究和快速临床诊断。随着科技的不断发展，出现了许多新的检测术，如：重组酶等温扩增技术包括重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）技术以及重组酶介导扩增(recombinase aided amplification，RAA)，在寄生虫检测方面得到了广泛的开发与应用，目前已经应用于原虫、吸虫、线虫和其他原生动物等寄生虫检测，RPA 技术比RAA 技术应用更广泛[20]。重组酶等温扩增技术填补了传统培养和依赖温变设备技术外的空缺，具有很大的应用前景，但是由于灵敏度较高，容易造成假阳性结果，反应过程中也容易产生非特异性条带，引物容易形成二聚体，目前仍处于摸索阶段[21]。宏基因组测序也在寄生虫病诊断中得到应用，该检测方法具有无偏倚性、覆盖度高，检测结果准确，可靠，逐渐应用于寄生虫感染的检测。但其应用还存在一定的局限性和不足，如敏感性不足、基因组数据库并不完善、成本较高、容易受外源DNA 干扰等[22]。综上所述，目前应用最广泛，相对较成熟的是PCR 和LAMP 技术。

在寄生虫的防控方面，首先应从日常管理下手，加强养殖场所的消毒与粪便清理工作，控制适宜的温度、湿度、光照及通风，提供干净的水和食物。其次针对本地区实际制订出一套科学、合理的疾病综合防制措施。最后是定期检测，选择有针对性的驱虫药物做好驱虫工作，提高试验猴的数量、质量及保证动物试验结果的准确性，防止疫情疫病的传播，保障从业人员人身安全，促进灵长类试验动物食蟹猴生产的可持续发展。