高效液相法测定饲料中黄曲霉素B1的不确定度分析

2022-12-10邓田方吴玉刚徐焕宇郑会祥

养殖与饲料 2022年9期

邓田方，吴玉刚，胡蝶，徐焕宇，郑会祥

广东粤海饲料集团股份有限公司，广东湛江 524000

饲料及其原料在生产、储存、运输过程中往往因操作不当，容易被霉菌污染，产生霉菌毒素，如黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、伏马毒素B1（fumonisin B1）等，黄曲霉毒素B1是饲料中最常见且危害较大的霉菌毒素，在动物饲料中存在15%～20%的超标污染[1]。黄曲霉毒素B1会导致动物生长受阻、饲料效率下降、免疫抑制、繁殖力下降[2]，也会诱导动物氧化应激[3]等不良作用，对养殖业造成了一定的影响。黄曲霉毒素B1不仅可以引起养殖动物的组织受损和代谢异常，同时也会在其组织中残留下来[4]，而黄曲霉毒素B1被世界卫生组织列为Ⅰ级致癌物，从而造成食品安全问题，可能危害消费者的身体健康。因此，明确饲料中的限量标准，准确检测饲料中AFB1的含量，对保障产品质量安全具有重要意义。为规范饲料市场，控制饲料质量，降低安全风险，农业农村部第2625 号公告对饲料中AFB1的限量做出了规定，并在2014 年7 月8 日发布了《饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》（GB/T 30955—2014），于2015 年1 月10 日实施，自此，AFB1在饲料行业中得到全面关注。

在具体测量操作过程中常存在由仪器设备、容量器具、标准曲线和人为操作等造成的不确定性，从而对饲料生产过程中产品安全监测和质量安全判定产生影响。因此，本研究根据JJF1059.1—2012《测量确定度的评定与表示》和GB/T 30955—2014《饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》中的高效液相法测定饲料中黄曲霉毒素B1的含量进行测定，找出影响测量结果不确定度的各种因素，对测定结果的不确定度进行评定，旨在为实验室在该检测过程中进一步提高检测数据的可靠性和一致性做参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1）标准品：AFB1标准品溶液（黄曲霉毒素B1标准溶液；Aflatoxin B11 μg/mL in Acetonitrile，英国LGC）。

2）试剂：乙腈、甲醇（色谱纯，DIKMA 公司）。

3）样品：南美白对虾配合饲料。

4）亲和柱：AFB1免疫亲和柱（北京华安麦科）。

5）色谱柱：AE1205-2546（C18 EPS，5 μm，4.6×250 mm，120）；0.45 μm 水系滤膜（天津市津腾实验设备有限公司）。

6）仪器设备。安捷伦1260 高效液相色谱仪、MS电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）、SCI412 离心机（SCJLOGEX）、HOKEE 纯水仪（宏科）、SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、溶剂过滤器（天津市津腾实验设备有限公司）、光化学衍生器（北京华安麦科）。

1.2 测量步骤

1）提取。称取试样（粒度＜1 mm）5.000 0 g（精确到0.000 1 g）于50 mL 离心管中，加入0.5 g 氯化钠及25.0 mL 甲醇溶液，以旋涡混合仪续高速震荡提取2 min，定量滤纸过滤，准确移取10.0 mL 滤液并加入20.0 mL PBS 缓冲溶液或纯水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1～2 次，至滤液澄清，备用。

2）净化。准确移取15.0 mL 样品提取液注入亲和柱，使溶液以不超过2 mL/min 流速缓慢通过亲和柱，待溶液全部流出后以10 mL 纯水清洗柱子2次，弃去全部流出液，加入1 mL 甲醇洗脱，流速不超过1 mL/min，收集全部洗脱液于样品瓶中，用氮吹仪在≤50 ℃下吹干，准确加入1.000 mL 流动相溶解，过滤后供色谱检测用。

3）色谱测定。分别取相同体积样品液和标准工作溶液（1、2、5、10、50 ng/mL）注入高效液相色谱仪，测定样品溶液的响应值（峰面积），样品溶液与黄曲霉毒素B1标准溶液色谱图比较得到试液中黄曲霉毒素B1的质量浓度（ng/mL）。

1.3 数学模型

V，样品提取溶液体积，单位为mL；

Vi，样品的总稀释体积，单位为mL；

ci，试液中黄曲霉毒素B1的质量浓度，单位为ng/mL；

m，试样质量，单位为g。

2 结果与分析

2.1 测定结果

对试验样品重复测定7 次，称量样品质量为5.000 0～5.002 3，提取后，样液稀释5 倍后进行测定，样品中黄曲霉毒素B1含量为2.0～2.2 μg/kg，平均值为2.1 μg/kg，相对标准偏差为3.55%（表1）。

表1 黄曲霉毒素B1 的测定结果

2.2 质量引入的不确定度urel（m）

天平引入的不确定度：从校准证书中可以找到所用的电子天平在称量0≤m≤50 g 时，u（m）=0.17 mg（k=2），则其标准不确定度为：

试验中称量样品质量的平均值为m=5.000 2 g ，则质量引入的相对标准不确定度为：

2.3 样品试液处理过程体积引入的不确定度urel（v）

黄曲霉毒素B1提取和定容过程中引入的不确定度包括刻度移液管和移液器的允差和温度引起的水的体积变化2 个部分，该过程引入的不确定度包括以下4 个方面。

1）由25 mL 刻度移液管产生的不确定度u（V1）：刻度移液管的证书所标示的扩展不确定度为0.02 mL（k=2），则25 mL 刻度移液管标准不确定度为：

由于试验在20 ℃的环境下进行，在该试验中用到的刻度移液管等其校验证书上显示的温度均为20 ℃，因此由温度引起的不确定度可忽略不计（以下容器相同），则在量取25 mL 溶液时，其相对标准不确定度为：

2）10 mL 刻度移液管产生的不确定度。刻度移液管的证书所标示的扩展不确定度为0.01 mL（k=2），则10 mL 刻度移液管标准不确定度为：

则在量取10 mL 溶液时，其相对标准标准不确定度为：

3）由100～1 000 μL 的移液枪产生的不确定度，从证书中可找出扩展不确定度（k=2），在制定样品溶液定容时：量取1 000 μL 流动相溶解黄曲霉毒素B1，其相对标准不确定度为：

4）将urel(V1）、urel（V2）、urel（V3）合成，得体积引入的相对标准不确定度为：

2.4 标准曲线引入的不确定度urel（b）

1）标准品引入的不确定度urel（b1）。本试验所用的黄曲霉毒素B1标准溶液质量浓度为1.00 μg/mL，证书中标示的扩展不确定度为0.03 μg/mL（k=2），黄曲霉毒素B1标准溶液的标准不确定度为：

2）标准曲线最小二乘法拟合引入的不确定度urel（b2）。对黄曲霉毒素B1的标准溶液的每个浓度测量3 次，共15 次，测得浓度与峰面积的对应值（表2）。以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，拟合曲线方程y=ax+b，得到回归方程：A=3.7925C-0.5979（A：峰面积；C：标准浓度），相关系数R2=1。

表2 标准工作液浓度的峰面积

样品试液质量浓度为C0=2.1 ng/mL，p=7，n=15，测该拟合曲线的标准不确定度为：

7 次测得样品试液的平均质量浓度为2.1 ng/mL（表1），则其相对标准不确定度为：

式中：

a，标准曲线的斜率；

Aj，黄曲霉毒素B1工作溶液浓度相对应的峰面积；

Cj，吸光值对应的黄曲霉毒素B1工作溶液浓度；

C，黄曲霉毒素B1工作溶液的平均值；

c0，样品试液检测浓度的平均值；

p，测量样品次数；

n，测量黄曲霉毒素B1工作溶液的次数。

3）仪器自身带来的不确定度urel（b3）。从校准证书中找到所用的液相色谱仪1260 的扩展不确定度为5.2%（k=2），其相对标准不确定度为：

4）标准溶液稀释、定容引入的不确定度urel（b4）。其不确定度主要是由100～1 000 μL 和10～200 μL的移液枪引入。黄曲霉毒素B1标准液稀释的过程：移取1 000 ng/mL 黄曲霉毒素B1的标准溶液100 μL，加900 μL 流动相，配制成100 ng/mL 的黄曲霉毒素B1储备标准溶液u（b4-1），取500 μL 储备液+500 μL 流动相配制成50 ng/mLu（b4-2），取100 μL储备液+900 μL 流动相l 配制成10 ng/mlu（b4-3），取50 μL 储备液+950 μL 流动相配制成5 ng/mLu（b4-4）；取20 μL 储备液+980 μL 流动相配制成2 ng/mlu（b4-5）；取500 μL 标准液（2.4.4.5）+500 μL流动相配制成1 ng/mLu（b4-6），100～1 000 μL 和10～200 μL 移液枪的扩展不确定度均为为：（k=2），其标准不确定度均为，根据稀释步骤，可得稀释过程中产生的相对标准不确定度为：

标准溶液稀释、定容引入的相对标准不确定度合成为：

5）标准曲线引入的相对标准不确定度合成urel（b）：