缑一杰， 冯嘉玥， 苏新雷， 柯 健

(1.杨凌职业技术学院 生物工程分院， 陕西 杨凌 712100； 2.西北农林科技大学 园艺学院， 陕西 杨凌 712100； 3.陕西东篱下现代生态农业有限公司， 陕西 西安 710000； 4.陕西省汉中市略阳县农业技术推广中心， 陕西 汉中 724300)

0 引言

【研究意义】草莓(FragariaananassaDuch.)属多年生草本果树，蔷薇科(Rosaceae)草莓属，原产于南美洲，目前种植面积广泛，在中国和欧洲等地均有种植。草莓因其果实含有极高的营养价值而素有“水果皇后”的美称，已成为植物学研究领域中的重要模式物种。近年来，草莓作为草本果树逐渐发展为可进行基因功能研究的模式植物，八倍体栽培草莓的高效遗传转化体系被广泛研究，然而其高度杂合的特点使再生周期和遗传转化周期较长[1-3]。二倍体草莓基因组较小，是更为理想的模式植物，其高效再生体系是开展草莓基因工程研究的前提[4-7]。因此，以野生二倍体草莓Yellow wonder子叶为材料，研究其子叶高效再生体系，对野生草莓的遗传转化研究与应用具有重要意义。【前人研究进展】植物激素浓度配比是影响草莓叶片再生的重要因素，细胞分裂素和生长素分别促进芽的产生和根的形成，2种激素的浓度及配比显著影响芽和根再生的效果。1988年，柯善强等[8]选择草莓试管苗的幼嫩叶片，在含有1.5～2.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的MS培养基上培养外植体，可诱导出不定芽，诱导率为20%；1989年，NEHRA等[9]发现，诱导Redcoat草莓叶片再生不定芽的最佳激素配比为6-BA 10 μmol/L+IBA 10 μmol/L。近年来，国内科学家对各类品种草莓的离体再生体系进行了大量研究。张经纬等[10]研究表明，二倍体草莓叶片不定芽分化率和分化速度均低于八倍体草莓。董莉等[11]建立了红颜草莓叶片的高效再生体系，最终筛选出最佳脱分化培养基为MS+TDZ 2.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L，最佳分化培养基为MS+TDZ 1.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L。杨仕品等[12]研究发现，章姬草莓在激素配比为TDA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基上，叶片再生率可达95.83%。乔瑞琪等[13]研究发现，二倍体草莓Ruegen在激素配比为TDZ 2.0 mg/L+IBA0.2 mg/L培养基上，叶片再生频率可达81%。【研究切入点】随着基因工程技术的快速发展，通过转基因技术加快草莓育种是必然趋势。而成功的基因转化必须依赖于高效稳定的再生系统[14]。外植体的选择是草莓再生技术的关键，由于叶片来源广泛、易于处理，草莓叶片已成为离体再生的最佳材料[15]，但利用草莓子叶作为再生材料的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】以野生草莓Yellow Wonder的子叶为材料建立高效再生体系，为丰富草莓再生材料来源及为草莓育种研究和其他生物技术研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 二倍体野生草莓Yellow Wonder种子采摘于西北农林科技大学。

1.1.2 主要试剂 2%次氯酸钠、75%酒精、IBA、6-BA、琼脂和蔗糖均为市购。

1.1.3 培养基及培养条件 种子萌发培养基为1/2 MS+3%蔗糖(液体培养基，pH 5.8)；子叶再生培养基9种(表1)；不定芽继代培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L；生根培养基分别为MS+IBA 0.1 mg/L和MS+IBA 0.2 mg/L。所有培养基蔗糖和琼脂均分别为30 g/L和8 g/L，pH 5.8，光照强度3 000～5 000 Lx、光周期16 h /8 h、温度(25±2)℃。

表1 草莓子叶再生培养基的激素配比

1.2 试验方法

1.2.1 外植体制备 将草莓种子在碱性洗衣粉水中浸泡15 min，冲洗干净后于无菌水中浸泡过夜，用旋涡振荡仪破除种皮，无菌滤纸吸干种子表面水分，75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗2～3次，在超净工作台上用2%次氯酸钠溶液消毒10 min，无菌水冲洗2～3次，清洗时剧烈摇晃。在无菌条件下，用不加琼脂的液体萌发培养基将无菌滤纸浸湿，种子接种于滤纸上， 4℃暗培养2周后转移到组培间[光照强度3 000～5 000 Lx，光周期16 h /8 h，温度(25±2)℃]进行萌发培养，计算发芽率。

发芽率=(发芽种子数/种子总数)×100%

1.2.2 不同激素配比下子叶诱导不定芽试验 子叶充分展开后，用手术刀和镊子取子叶前端部分(1～2 mm)，正面朝上接种于不同激素配比的9种子叶再生培养基中培养。暗培养7 d后转入长日照环境中培养40 d，统计外植体的脱分化数量和再分化数量，计算出愈率和分化率。每个处理3次重复。

出愈率=(产生愈伤子叶数/接种子叶总数)×100%

分化率=(产生再生芽子叶数/接种子叶总数)×100%

1.2.3 不同暗培养时间下子叶诱导不定芽试验 培养基为子叶诱导不定芽试验的最佳分化培养基，暗培养时间设置为0 d(CK)、3 d、7 d和14 d，子叶暗培养结束后改为光暗交替培养40 d。统计外植体的脱分化和再分化数量，计算出愈率和分化率。每个处理3次重复。

1.2.4 不同IBA浓度下不定根诱导试验 将不定芽转接到继代培养基上持续生长，待芽茎伸长至1～2 cm时，将其自基部切下转接至生根培养基上，比较IBA浓度分别为0.1 mg/L和0.2 mg/L不定根的生长情况，14 d后统计平均根数，计算生根率。每个处理3次重复。

生根率=(长出不定根再生芽数/总芽数)×100%

1.2.5 不同子叶部位诱导不定芽比较试验 用镊子和解剖刀切取子叶前端、子叶中部和带柄子叶3个部位，分别接种于子叶诱导不定芽试验的最佳分化培养基上培养40 d，筛选出最适宜诱导不定芽的子叶部位。每个处理3次重复。

1.2.6 炼苗与移栽 选择健壮、根系发达的再生苗20株，喷少量纯水，打开瓶盖在室外炼苗。3日后洗去根部的培养基假植于装有基质的营养钵中，覆盖透明塑料盖保湿，14 d后统计移栽存活率。揭开塑料盖继续培养20 d移栽至大田。

1.3 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2007和IBM SPSS Statistics Version 19进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 草莓种子的萌发情况

草莓种子进行无菌萌发培养，种子经2周黑暗4℃处理后，在组培间培养第4天开始发芽(图1 a、b)，出芽率为20%，第10天时发芽率达90%(图1 c)。

2.2 不同浓度激素草莓子叶不定芽的再生效果

从表2看出，培养Yellow Wonder子叶不定芽再生效果最好的激素配比是处理6(6-BA 3.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L)，出愈率为93.33%，分化率为83.33%，明显高于其他激素处理组合；当6-BA浓度增高到4.4 mg/L时，不定芽分化率呈明显下降趋势，且有明显玻璃化现象的产生，长势变弱。

表2 不同激素配比下草莓子叶不定芽的再生效果

2.3 不同暗培养时间草莓子叶不定芽的再生效果

从表3看出，经不同暗培养时间后，暗培养7 d的出愈率和分化率均最高，分别达90.74%和85.93%，均显著高于CK；暗培养14 d时子叶边缘和伤口处有轻微褐化现象。表明，诱导Yellow Wonder草莓子叶不定芽的暗处理最佳时间为7 d。

表3 不同暗培养时间下子叶不定芽的再生效果

2.4 IBA不同浓度诱导草莓不定根的效果

从表4看出，较高浓度IBA对草莓不定根的诱导较好，IBA浓度为 0.2 mg /L时，生根率可达100%，平均根数11.8条。

表4 IBA不同浓度诱导草莓不定根的效果

2.5 草莓子叶不同部位不定芽的再生效果

从表5看出，草莓子叶前端、子叶中部、带柄子叶3个部位接种于6-BA 3.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L的再生培养基上诱导40 d后，不定芽出愈率最高的是子叶中部，为94%；其次是带柄子叶，为90%；子叶前端最低，为85%。接种3个部位不定芽的分化率也以子叶中部最高，为85%；其次是带柄子叶，为79%；子叶前端最低，为60%。表明，最适宜诱导草莓子叶不定芽的部位为子叶中部，其次是带柄子叶。

表5 草莓子叶不同部位不定芽的再生效果

2.6 再生苗移栽成活率

20株再生苗经炼苗、假植、移栽后存活率达100%，均可正常开花结果，无病害发生。

3 讨论

在自然条件下，草莓种子很难正常发芽[10]，需对种子进行特殊处理才会提高发芽率[16-17]。研究通过消毒前对种子进行过夜浸泡，用旋涡振荡仪破除种皮，并在消毒完成后对种子进行2周低温春化处理，种子发芽率达90%。除基因调控外，激素的种类和浓度是影响草莓叶片再生的主要因素。细胞分裂素利于不定芽的形成，生长素可促进生根，将二者进行不同浓度搭配后可调节不定芽的形成[18]。NYMAN等[19]研究得出，Redcoat草莓叶片再生的最佳激素配比为6-BA 10 μmol/L+IBA 10 μmol/L；周鹤莹等[20]研究表明，二倍体草莓Hawaii4在6-BA 3.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L的培养基上再生频率达80%。研究结果表明，Yellow Wonder草莓子叶在6-BA 3.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L的再生培养基上培养，不定芽出愈率为93.33%，分化率为83.33%，适合用于遗传转化研究。

暗培养时间是影响草莓叶片再生的重要因素[13]，暗培养有利于加快愈伤组织的形成并减少酚类物质的产生，减轻褐变[7]。不同品种和基因型草莓适合的暗培养时间有所不同，二倍体草莓Hawaii4的暗培养时间是3 d[20]，丰香草莓是28 d[21]，红颜草莓是10 d[8]；试验中Yellow Wonder草莓暗培养的最佳时间为7 d，出愈率和分化率均最高，分别达90.74%和85.93%。不同子叶部位的再生能力有所不同，如辣椒子叶再生培养中，以较嫩的子叶和子叶中部容易诱导愈伤组织和植株再生[22]，这与本研究草莓子叶最适宜部位为子叶中部的结论相一致。

4 结论

研究建立了野生草莓Yellow Wonder子叶的高效再生体系，即将Yellow Wonder草莓种子在萌发培养基(1/2 MS+3%蔗糖)中培养至发芽；将子叶中部切下，正面朝上置于子叶再生培养基(6-BA 3.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L)上；在室温条件下暗处理7 d后，转入(25±2)℃长日照条件下培养40 d诱导出不定芽；不定芽转接到继代培养基(MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L)上持续生长，待芽苗伸长至1～2 cm后，再转接到生根培养基(MS+IBA 0.2 mg/L)中进行生根培养。再生苗经炼苗、假植、移栽后，存活率达100%，且可正常开花结果，无病害发生。