唐 玲，孙思琦，闫 桦，刘亚昕，刘大丽

（1国家甜菜种质中期库/黑龙江大学，哈尔滨 150080；2黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080）

0 引言

甜菜红色素是一种水溶性含氮天然色素，在细胞质中合成，存于液泡[1]。它是甜菜醛氨酸(betalanic acid)的衍生物，可分为红色的甜菜红素和黄色的甜菜黄素2类，两者的比例决定了色素提取物的颜色[2]。甜菜红素由甜菜醛氨酸和二羟基苯丙氨酸结合而成，而甜菜醛氨酸与其他氨基酸相结合时，则产生甜菜黄素[3]。甜菜红素包括甜菜红苷、甜菜黄素、异甜菜苷、前甜菜红苷、异前甜菜苷及甜菜色素的降解物[4]。其中甜菜红苷为主要成分，占比达75%～95%[5]。甜菜黄素包括甜菜黄素I和甜菜黄素II[6]。这些色素存在于除粟米草科(Molluginaceae)和石竹科(Caryophyllaceae)以外的10个石竹目(Caryophyllales)植物中，在一些真菌中也发现过[7]。因最早发现于甜菜(Beta vulgaris)根中而得名甜菜红色素。此外，红甜菜根中的甜菜红素含量明显大于其他植物，根据提取过程的不同，每100 g干物质中含有40～600 mg甜菜红素[8]。

随着食品添加剂的应用持续增加，食品安全成为当前重大难题，尤其是在许多发展中国家。近些年因色泽问题导致的安全事件频频发生，促使许多合成色素退出市场，此时天然色素因色调自然、无毒无害及诸多特殊生理功能吸引了大众目光。甜菜色素作为四大天然色素之一[9]，具有安全性、丰富性、易提取性、生物有效性和生物可降解性等价值特性。其加工后不仅能够保持明艳的色泽，还可以降低患心血管疾病风险、保护神经、抗病毒，甚至通过抑制脂质氧化、过氧化来防止应激障碍相关疾病的发生。因此，现今已成功应用于食品、化妆品、医药、工业等领域。虽然在苋科和仙人掌科植物中也有甜菜红素的替代来源[10]，但商业生产用到的甜菜红素大部分来源于红甜菜根。而人们对甜菜红素的大量需求使其高提取率成为当前的研究重点。传统的提取方法如溶剂萃取、浸渍、煮沸、研磨等操作简单，但存在提取效率低、色素损失大、污染环境等缺点。为了解决这些问题，科学家们开始采用一些新的处理技术如超声波、微波、高压脉冲电场等，这些新兴技术极大提高了提取效率和提取质量。但在粗提的甜菜红素中仍然含有许多对色素的溶解性、透明度、色价及稳定性有影响的杂质，如蛋白质、果胶、糖、脂肪及无机离子等[11]。因此，如何除去这些杂质使色素成品纯度更高、稳定性更强，也是研究中的重中之重。

1 甜菜红素的提取技术

1.1 传统提取技术

经过长期实践，甜菜红素的传统提取技术被认定为安全可靠的技术。传统方法有溶剂提取法、连续扩散法等。甜菜红素是亲水性化合物，因此在提取甜菜红素上应用最多的是溶剂提取法。其原理是利用原料中各组分在不同溶剂中溶解度的差异，达到提取分离的目的。其过程一般是热烫、切丝、浸提、压榨和浓缩。虽然对甜菜红素的提取通常在水中实现，但大多数情况需加入甲醇或乙醇才能实现完全提取[12]，必要时也可以加入柠檬酸、抗坏血酸来提高提取率[13]。Sturzoiu等[13]对比了不同溶剂提取甜菜根干样中甜菜红素的提取率，发现提取能力最高的溶剂为0.2%柠檬酸和0.1%抗坏血酸水溶液，并且通过观察提取物存储10天期间甜菜红素含量的变化，发现0.2%柠檬酸和0.1%抗坏血酸水溶液的提取物色素损失最少。这充分表明弱酸不仅能提高色素的提取效果，还能在提取和储存过程中提高色素的稳定性。熊勇等[14]以红甜菜为材料，优化出甜菜红素的最佳提取工艺：在常温下，以水作提取溶剂，料液比1 g:5 mL，时间5 h，pH 4.5。其中溶剂pH对色素提取有较大影响，料液比和提取时间则无明显影响。然而晏兴珠等[15]以红色藜麦果实为材料时，发现影响提取效率的最显著因素是料液比，其次是提取时间，最后是提取温度，且最佳提取条件也与熊勇等大不相同。由此可看出，从不同种类的植物中提取甜菜红素时，因植物内部组成成分和含量有所差异，最佳工艺参数及提取效果也不尽相同。溶剂提取法存在操作简单、成本低、安全可靠的特点，但提取效率低，提取质量较差，且由于加入了有机溶剂，污染环境，不利于可持续发展。连续扩散也经常使用，但用这种方法提取的色素仍然含有高浓度的糖、盐和其他杂质[16]。因此，在这些传统提取技术的基础上，一般还会采用微波辅助、超声波辅助、高压脉冲电场和γ射线辅助等方法来克服这些缺点。

1.2 新兴技术

在传统技术基础上，顺应生产的需要新增了许多辅助方法，这些方法已被证明能以最小降解率来提高生物源中生物活性物质的提取率，是提高提取样品质量的有效方法。由于在提取过程中提取温度较低，这些技术也被称为冷提取技术。它们可以作为预处理方式，也可以同安全的有机溶剂配合使用来提高提取率。甜菜红素释放到提取介质中的量是由细胞解体的程度决定的，因此新的加工技术通常是改善了细胞膜的通透性，这也被认为是决定提取效率的主导参数[17]。

1.2.1 超声波辅助技术 超声波辅助提取法的萃取效果主要归因于溶剂中产生的空化效应，它能够击穿细胞壁，促使溶质中的有效成分扩散到溶剂中[18]。同时，机械效应促使着溶剂更容易渗透到溶质基质中，增加了固相和液相之间的接触表面积，从而提高提取效率[19]。该设备产生的声波频率超出了人类听力范围，有效频率在20～100 kHz[20]。近些年，超声波辅助法已广泛应用到热不稳定活性物质的提取及低温食品的加工中。Maran和Priya[18]应用4因素3水平试验设计，对超声波辅助提取废红甜菜秸秆中天然色素的工艺进行了优化。他们发现料液比为1 g:19 mL时，在53℃、89 W超声下提取35 min，色素得率达到最高值（甜菜红素1.29 mg/g，甜菜黄素5.32 mg/g）。Fernando等[21]发现，超声辅助法比酶辅助法更适合对红甜菜干粉中甜菜红素和多酚的联合提取。虽然酶的存在可能会导致甜菜红素降解，但在干样中这些酶是没有活性的。超声辅助提取能够在室内温和大气压下使用少量溶剂快速提取色素，是一种环保、低耗、高效的提取技术。但在提取甜菜红素的过程中伴随着产生自由基物种的可能性，且超声设备昂贵，维修管理复杂，成本较高，在生产应用中受到一定限制。

1.2.2 微波辅助提取技术 微波辅助提取是一种利用波长为100µm～1 cm之间的波与萃取溶剂中的极性分子相互作用的方法。在微波辐照过程中细胞受到热应力，内部压力增大，导致细胞壁和细胞膜破裂，从而显著减少了提取时间[22]。Thirugnanasambandham和Sivakumar[23]以火龙果皮为材料，通过响应面法(RSM)优化了微波辅助提取的工艺参数，发现20 g的样品在35℃时处理8 min能获得9 mg/L的甜菜红素。Cardoso-ugarte等[24]通过微波辅助一步法提取甜菜红素，发现在等效时间内，与常规萃取法相比，色素对溶剂的释放量要高得多。为了在减少降解的同时增加色素提取，采用微波辅助两步法，通过在萃取溶剂中加入L-抗坏血酸保护提取物免受降解，并在冷却过程中帮助色素再生。该方法进一步提高了该提取过程的精确度，提高了萃取率。微波辅助提取法是一种绿色环保的提取技术，常用于有机污染物、天然化合物和生物活性物质的提取。在室温和大气压下就可以操作，提取效率高、得率高，节约溶剂和资源。但是它对非极性或挥发性化合物的提取能力较差，对生物活性化合物的化学结构有影响，且仅适用于有限数量的样品。

1.2.3 高压脉冲电场 高压脉冲电场技术(PEF，pulsed electric field)是一种利用电场从总萃取物中分离色素的方法，近年来因其在食品加工和保鲜中的应用而被广泛研究。它是通过在室温下对2个电极间的样品多次施加高电压(0.1～50 kV/cm)的短脉冲，在细胞组织不被破坏的前提下，导致细胞电穿孔，从而使非导电膜被压缩至破裂[25-26]。这一技术被证明对微生物灭活、提高压榨效率或增强植物汁液提取、强化食品脱水和干燥非常有效[27]。Luengo等[28]证实了在毫秒和秒范围内应用PEF处理对红甜菜细胞的解体是有效的。在提高甜菜红素提取率方面，就总比能量消耗而言，秒范围内的处理比毫秒范围内的处理更有效。Visockis等[29]采用PEF从新鲜的红甜菜根中提取甜菜红素，发现提取率主要取决于电场强度和比能量输入，但当比能量输入较低时，由PEF处理时间决定甜菜红素的提取率。另外，为了更直观地评估红甜菜根组织的崩解程度，他们采用组织渗透性指数(Zp)的计算和上清液电导率的测定2种方法进行比较。研究表明，测定上清液电导率比Zp更能反映甜菜红素的提取率。总的来看，PEF辅助水溶液从新鲜红甜菜根中提取甜菜色素是一种有效、节能、环保的方法，可以作为传统提取技术的替代方法。PEF能在保持食品的营养特性及品质的基础上，以低能源、低成本的方式提高色素提取能力。然而，这种方法主要缺点是使用的电极可能受到腐蚀，电极材料可能会浸入食物系统，因此，不锈钢电极需要用其他不受腐蚀的材料来代替[30]。另外，PEF的效率与电场强度和电极间隙的影响高度依赖，且设备成本高，对工艺参数的控制要求极其严格。

1.2.4 其他提取方法 除了以上研究较多的提取技术外，γ射线辅助提取、超临界CO2萃取、酶法、膜加工等技术均被应用于甜菜红素的提取研究中。γ射线辅助提取是通过改变细胞壁和细胞膜的通透性以及降低膨压，促使细胞内容物流出，达到提高提取效率和产出率的目的。Nayak等[31]在固液萃取过程前，采用γ辐照作为预处理，并与对照甜菜根样品进行比较。结果表明，随着γ辐照剂量(2.5-10.0 kGy)的增加，甜菜红素的提取效率提高，但当γ射线剂量超过10 kGy，甜菜红素的结构会改变。而Latorre等[32]观察到，鲜切的红甜菜根暴露在1～2 kGy的低剂量γ辐照下，细胞内的结构也会发生变化。一般情况下，从生物材料中提取化合物时，会经历低温，因此可以在提取过程中加入加压溶剂。超临界CO2萃取技术就是通过对溶剂提供一定的压力和温度条件来控制其理化性质（密度、扩散系数、粘度和介电常数），从而提高溶剂对细胞基质的渗透和细胞内部成分向外的渗透，达到对特定有效成分进行分离的目的[33]。超临界萃取技术常见于辣椒红色素、栀子黄色素以及β-胡萝卜素等色素的提取中，在提取甜菜红素上的研究仍然较少。Idham等[34]从玫瑰花花萼中分离天然红色色素时发现，与传统的固液萃取法相比，使用超临界二氧化碳法能够提供更低的降解率。酶法是利用酶的专一性选择合适的酶，溶解纤维素、半纤维素及果胶，使细胞内的有效成分易于溶出[35]。Zin等[36]测试2种反渗透膜（RO99和X20）对废弃甜菜根皮中提取果汁浓度的效率。结果证明RO99所达到的浓度水平优于X20。表现在抗氧化剂和总酚类化合物的保留量达到99.99%，甜菜红素的保留量也超过95%。这说明膜技术可以广泛地应用于植物废弃物中有价值化合物的浓缩或分离。

2 纯化技术

甜菜红素粗提成品的品质、稳定性、着色力均较差。这是由于粗提的甜菜红素中仍然含有影响色素溶解度、透明度、色价和稳定性的大分子及杂质，如糖、脂肪、果胶、蛋白质、甜菜黄素及无机离子等。因此还需要对提取物加工精制，以提高甜菜红素成品的色价和品质。目前纯化方法包括大孔树脂吸附法、微生物发酵法、膜处理法等。

2.1 大孔树脂吸附法

大孔树脂吸附法是对天然色素纯化的最常用方法。大孔树脂吸附是利用范德华力、静电力、氢键等多种物理吸附力实现对有机物质的分离[37]。该吸附法的实质是一种由物体高度分散或表面分子受力不均引起的表面吸附现象。树脂有很多型号，通常实验者根据本身实验要求选取合适的型号并设计实验。陈宇等[38]采用静态吸附和解吸实验比较6种型号树脂对红、白火龙果色素分离纯化效果。实验数据表明S-8的效果最好，其吸附率为63.2%，解析率为26.3%，且纯化后色素的色价分别是纯化前的5.26、5.31倍。楚朝霞[39]比较了S-8、X-5、AB-8 3种树脂的吸附解析效果，最终确定AB-8型大孔树脂为最优树脂，并选用该型号树脂作为下一步实验材料。吕思润[40]对比10种树脂吸附解析效果，最后综合考虑选择X-5大孔树脂为分离纯化最优树脂。并以此作为初步纯化的实验材料，然后采用Sephadex LH-20对甜菜红素进行二次纯化，最后样品中甜菜红素含量为61.108 mg/g。HPLC的结果分析表明，一次纯化能够大大减少甜菜黄素的含量，二次纯化能够除去甜菜黄素。大孔树脂吸附法操作简单、节省能源、产品纯度高、不吸潮、色价好且树脂可重复使用，但是处理时间较长，效率不高且树脂易受污染。

2.2 微生物发酵法

微生物发酵法纯化不仅对甜菜红色素影响较小，还能有效去除糖、硝酸盐和亚硝酸盐等杂质[41]。有学者研究反硝化细菌对红甜菜汁反硝化的最佳条件时，在25℃和30℃，初始pH 7.0～8.0，甜菜汁渗透压为900～1100 mOsm/kg的细菌培养过程中，发现了硝酸盐的总还原。并且发现微生物反硝化过程影响了果汁的颜色、味道和香气，但是通过酸化作用和水与挥发性物质的部分蒸发，使用甜菜汁作为食品色素和营养成分也是可行的[42]。此外，杨帆比较了4种酵母的去糖水平，发现发酵时间越长，提取液含糖量降低幅度越大。其中高活性安琪酵母表现最佳，使提取液中含糖量下降64.2%。Gengatharan等[43]筛选了4种乳酸菌（嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌）和1种酵母（酿酒酵母），测定其降低红心火龙果提取物中糖含量的效率。其中酿酒酵母对糖含量影响最大，且发酵变量影响甜菜红素提取物含量及其中的总糖含量。因此，优化发酵参数对提高发酵效率具有重要意义。

2.3 膜分离技术

膜分离技术是一种可在常温下进行的新型分离技术，包括微滤膜技术、超滤膜技术、纳滤膜技术、反渗透膜技术、渗析膜技术、正渗透技术。研究表明微滤膜有助于去除甜菜汁99%的浊度，并通过随后的过滤达到稳定的通量[44]。超滤膜介于微滤、纳滤之间，主要截留机制包括筛分作用和静电作用。纳滤膜可以将色素溶液中的金属离子、硝酸根离子和小分子有机酸等物质滤出。周宏璐和王景会[45]发现超滤、纳滤结合分离的方法不仅能够去除甜菜红素溶液中的水分和杂质，还能有效控制糖的滤储量，生产不同色价的产品。膜分离过程是一种纯物理过程，操作简单，适用范围广，能有效保持分离成分的理化性质和生物活性，兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能。

2.4 其他纯化方法

凝胶层析分离法是一种液相层析法，主要依赖分子筛效应，可在很大的温度范围下进行，并能够使分离成分的理化性质基本保持不变[46]。甜菜红素纯化时一般采用Sephadex G-25或Sephadex LH-20，使用时，用去离子水溶胀凝胶即可[47]。Schliemann等[48]发现在分离美洲商陆细胞培养物中的甜菜红素时，用Sephadex LH-20代替离子交换色谱法，可以避免不稳定的甜菜红素异构体的分解。离子交换色谱法是以离子交换剂作为固定相，以含特定离子的溶液作为流动相，用于分离混合物各组分。双水相萃取法易于连续操作，处理量大且能耗低，故可大规模应用。Chethana等[49]在较高的拉线长度(34%)的水相提取中，实现了甜菜和糖的差异分配，其中甜菜红素（约70%～75%）和糖（约＞90%）分别在顶部和底部分配。从聚合物中成功分离出的甜菜红素浓度增加了3.4倍。Ahmadi等[50]采用正相柱色谱法(NPC)对红甜菜根提取物中的甜菜红素进行纯化。从100 g红甜菜根中获得(500±22)mg甜菜红素，其净化效率大约是其他研究中已报道的最大值的5倍。Goncalves等[51]对甜菜红素的7种纯化方法进行比较，结果表明离子交换色谱法最高效，能够从100 g新鲜甜菜根中纯化89.1 mg甜菜红素，但这种方法比较耗时，且纯化后的物质中仍含有大量的盐，显示出了高电导率。另外反相高效液相色谱法和反相柱层析法在效率和得率上表现出了最佳平衡。

3 甜菜红素的应用

近些年来，随着国内外学者对甜菜红素诸多益处的发掘，这种天然色素已经应用到日常生产中。而甜菜红素也是唯一一种被FDA批准用于食品、化妆品中的天然添加剂[52]。

3.1 食品

甜菜红素无毒无害，色泽明艳，具有许多特殊营养成分，现已成功作为着色剂、天然膳食补充剂和食品添加剂代替合成色素应用于食品中。作为着色剂，它能够将食品和饮料染成粉红色、红色或紫色。一般在热环境下甜菜红素性状不稳定，因此常用于乳制品染色[53]（如酸奶、沙拉酱、冰淇淋、明胶甜点、淀粉布丁）。肉类会发生脂质过氧化，这会对其感官特性、营养价值和保质期产生不利影响，并可能产生对健康有害的化合物，而甜菜红素具有着色剂和抗氧化剂的优势，加入可以改善这些危害（如在香肠、熟火腿中加入甜菜红素）[54]。另外，甜菜红素还应用于制作饮料、营养面、油炸零食、饼干等食品。据统计，2009年红甜菜红色素占全球食品着色剂的10%[55]。但是Khan[56]建议甜菜红素每人每日最大摄入量不应超过100 mg。

3.2 药品及保健品

甜菜红素在医药的应用上，目前最多的是将其作为着色剂，一是为了便于区分药品，二是美化药品外观，吸引儿童服用。如在糖衣药片中加入5%的甜菜红素就能和胭脂红效果相同[57]。另外，加入甜菜红素有助于保护药物的生理活性。美国利用甜菜红素的抗氧化性，在液体药剂中加入一定量的甜菜红素后，药剂的保质期得以延长。甜菜红素还作为营养强化剂应用在幼儿奶粉、老人保健品、功能性饮料和食品中。

3.3 工业

市面上有很多日化品像沐浴露、洗发水、香皂、彩妆等都需要丰富的色彩美化，但是合成色素不仅有致癌风险，还有很多过敏源，对易过敏人群不友好。而甜菜红素这种天然色素不仅色泽鲜艳、安全无毒、稳定性强，还含有抗氧化成分和抗癌性，广受各大日化品公司青睐。羊毛[58]、蚕丝[59]等的染色也依赖于它。另外，由于其吸收光的特性和转移电子的能力，在作为染料敏化太阳能电池的光敏剂上也表现出一定的价值与潜力[60]；利用其抗氧化的特性应用于食品包装，既健康安全，还能延长食品的保质期[61]；当其作为绿色缓蚀剂时，具有成本低、技术要求低、利于可持续发展等独特优势[62]。

4 展望

自发现甜菜红素至今，人们已不断发掘出其抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤活性、提升免疫力、改善认知障碍等生理功能；有研究指出它在肝损伤、间质性肺炎缓解上也有显著作用[63-66]。因此，近些年甜菜红素被广泛应用于食品、医药、化妆品、工业等领域，其中食品方面应用最多，而医药领域仅限于功能性食品及保健品。甜菜红素的广泛使用带来的问题是如何进行大规模生产甜菜红素，其生产包括提取和纯化。传统萃取技术收率低、稳定性差、污染环境且批次之间存在差异。而新兴技术是在传统技术上增加了一些辅助方法，如超声波、微波、高压脉冲电场等技术，这些技术可以作为预处理或与环境友好和安全的有机溶剂联合使用。不仅提高了加工步骤的安全、环保性，还提供了更高的回收率和更均匀的产品。综合来看，在未来对甜菜红素的研究中，需着重考虑：（1）目前仍然需要开展更多的临床试验，以进一步研究甜菜红素的药理作用以及相关药品的研制，从而促进其在医药行业的应用。（2）传统和新兴技术的结合使用将成为提取技术的主要方向，另外还要不断优化工艺参数，只有工艺参数标准化，技术才能广泛应用于规模化生产。（3）经过粗提的初成品中仍然存在许多影响色素溶解度、透明度、色价和稳定性的杂质，必须经过纯化工艺除去这些杂质，才能得到品质较好的色素成品。大孔树脂吸附法操作简单、节省能源、产品纯度高、不吸潮、色价好且树脂可重复使用，是目前最常用的纯化方法。（4）甜菜红素在未来具有巨大的发展前景，建议开发更多的甜菜红素来源植物，进一步研究其他来源植物的甜菜红素浓度、稳定性及可提取性，以确保甜菜红素的广泛应用。