丁文欢， 李 洁， 张雪佳， 樊思恩， 徐海燕*

(1.新疆医科大学中心实验室，新疆 乌鲁木齐 830054；2.新疆医科大学第一附属医院药学部，新疆 乌鲁木齐 830054；3.中国药科大学中药学院，江苏 南京 211198；4.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830054)

紫草被誉为“凉血之圣药”，活性成分为紫草素及其衍生物，有抗炎、抗菌、抗病毒等作用[1-7]，为紫草科植物新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.、内蒙紫草ArnebiaguttataBunge的干燥根[8]，其中后者即《中国植物志》记载的黄花软紫草[9]。紫草中萘醌类成分含量差异较大，导致药材品质参差不齐[10-12]，有学者建立了新疆紫草指纹图谱[13-16]，但其所用药材大多源于市售，会存在基源不清的可能，而且未与黄花软紫草进行比较。

课题组前期对野外采集的新疆紫草、黄花软紫草中萘醌类成分进行含量测定[17-19]，发现存在较大差异，并且不同产地同一药材亦然。本实验建立新疆紫草、黄花软紫草HPLC指纹图谱，并进行化学模式识别分析，以期为两者质量综合评价标准提供科学依据。

1 材料

MS105DU型电子天平(十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。β,β′-二甲基丙烯酰紫草素(批号15102821)、左旋紫草素(批号15102721)、去氧紫草素(批号15062422)、乙酰紫草素对照品(批号15120431)均由上海同田生物技术有限公司提供；β-乙酰氧基异戊酰紫草素对照品(批号P05M7F14235)由上海源叶生物技术有限公司提供；异丁酰紫草素对照品(批号wkq16101302)由四川省维克奇生物科技有限公司提供；(2-甲基正丁酰基)紫草素对照品(批号AV51-LDQR)由日本化成工业株式会社提供。新疆紫草、黄花软紫草采自新疆，经新疆医科大学中药资源教研室徐海燕教授鉴定为正品，具体信息见表1。乙腈、甲酸为色谱纯；石油醚(60～90 ℃)为分析纯；水为超纯水(由艾科超纯水机制备)。

表1 样品信息

2 方法

2.1 对照品溶液制备 分别精密称取左旋紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁、(2-甲基正丁酰基)紫草素对照品2、10、10、1、10、5、25 mg，置于25 mL量瓶中，乙腈定容至刻度，即得。取除(2-甲基正丁酰基)紫草素以外的6种对照品溶液适量，置于同一10 mL量瓶中混合；另取(2-甲基正丁酰基)紫草素对照品溶液3.5 mL，置于10 mL量瓶中。

2.2 供试品溶液制备 药材粉碎后过4号筛，取粉末约1.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，加入石油醚(60～90 ℃)50 mL，超声处理30 min，冷却，石油醚(60～90 ℃)补足减失的质量，滤过，量取续滤液(新疆紫草10 mL、黄花软紫草30 mL)，蒸干，残渣加乙腈溶解，转移至10 mL量瓶中，乙腈定容至刻度，摇匀，即得。

2.3 色谱条件 参考文献[17]报道，Agilent-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.05%甲酸(70∶30)；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长275 nm；进样量10 μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取新疆紫草供试品溶液适量，在“2.3”项色谱条件下进样测定6次，测得左旋紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁、(2-甲基正丁酰基)紫草素峰面积RSD分别为0.35%、0.22%、0.53%、1.70%、0.28%、0.45%、0.24%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取新疆紫草供试品溶液适量，于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.3”项色谱条件下进样测定，测得左旋紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁、(2-甲基正丁酰基)紫草素峰面积RSD分别为1.52%、0.45%、1.27%、1.84%、0.70%、1.12%、0.48%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 精密称取新疆紫草粉末6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定，测得左旋紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁、(2-甲基正丁酰基)紫草素含量RSD分别为1.67%、1.99%、1.84%、1.02%、2.05%、1.92%、2.07%，表明该方法重复性良好。

2.5 HPLC指纹图谱建立

2.5.1 共有峰确认 36批样品按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定，将所得色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012A版)进行峰匹配，见图1～2，共发现19个色谱峰，其中共有峰5个，即F-10、F-11、F-14、F-18、F-19；18批新疆紫草共有7个共有峰，即F-6、F-10、F-11、F-14、F-16、F-18、F-19；18批黄花软紫草有6个共有峰，即F-10、F-11、F-12、F-14、F-18、F-19，由于各批样品均含有2-甲基正丁酰基，而且含量高，分离效果好，故选择其作为参照，测得相对保留时间RSD为0～0.79%，相对峰面积RSD为0～96.41%。

2.5.2 相似度分析 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)》进行相似度评价，结果见表2。由此可知，新疆紫草除Ae-5、Ae-6相似度低于0.7外，其余16批均高于0.9；黄花软紫草除Ag-9、Ag-13相似度低于0.8外，其余16批均高于0.8；黄花软紫草、新疆紫草之间的相似度降低。

表2 36批样品相似度

2.6 聚类分析 将19个色谱峰峰面积导入Mataboanalyst进行聚类分析，结果见图3。由此可知，距离设定为15时，36批样品可聚为2类，2个品种之间有交叉现象，F-6、F-11、F-13、F-16、F-18、F-19在第1类样品中较低，而在第2类样品中较高；距离设定为10时，36批样品可分为4类，2个品种之间无交叉现象，其中第1类又可分为Ⅰ类(Ae-2、Ae-3、Ae-5、Ae-6、Ae-14、Ae-16、Ae-18)和Ⅱ类(Ag-2、Ag-3、Ag-4、Ag-6、Ag-7、Ag-8、Ag-10、Ag-11、Ag-12、Ag-13、Ag-14、Ag-15、Ag-16、Ag-17)，F-6、F-11、F-13、F-16、F-18、F-19在Ⅰ类样品中峰面积较低，而在Ⅱ类样品中几乎未出现，并且Ⅱ类样品中F-12峰面积较大，但Ⅰ类样品中不含该色谱峰，而第2类又可分为Ⅲ类(剩余11批新疆紫草)、Ⅳ类(剩余4批黄花软紫草)，其区别主要是所有色谱峰峰面积在Ⅳ类样品中均较高，而Ⅲ类样品中仅F-6、F-11、F-13、F-16、F-18、F-19峰面积较高，与相似度分析结果基本一致。

2.7 主成分分析(PCA) 图4显示，前2个主成分累积贡献率超过60%，故选择两者进行区分；36批样品分布比较集中，2个品种之间有重叠部分，表明其HPLC指纹图谱相似性较高，但大部分样品分布与种属一致，并且同一品种分布更集中。

2.8 正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA) 图5显示，解释能力参数R2X为0.945，R2Y为0.791，预测能力参数Q2为0.662，表明数据拟合效果较好，可用于区分2个品种。再提取OPLS-DA模型中19个色谱峰峰面积的变量投影重要性(VIP)值，见图6，可知大于1者有7个，分别为F-16(异丁酰紫草素)、F-18(β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁)、F-6(左旋紫草素)、F-19(2-甲基正丁酰基紫草素)、F-12、F-11(乙酰紫草素)、F-1，可作为差异标志物。

3 讨论

结果显示，新疆紫草、黄花软紫草并非完全按照种属归类，而是均有重合部分，其原因为两者均为软紫草属植物，亲缘关系较近，并且均被2020年版《中国药典》收录，但新疆地域广阔，前者在大多生长于海拔2 000～4 200 m的山地向阳坡、砾石山坡、洪积扇、草地等处，而后者大多分布在前山荒漠、砾石质山坡、戈壁等处，生境差异较大，同一品种不同产地亦然。另外，药材中化学成分的积累除了受生境、种类的影响外，也与生长年限相关，但本实验中的新疆紫草、黄花软紫草均为野外采集，不能确定其生长年限。

野外调查发现，新疆紫草根发达，栓化较明显，色深，特异性气味明显；黄花软紫草主根明显，但不够发达，木栓层较薄，黄白色木部所占比例较大，特异性气味弱，两者性状存在明显差异，导致新疆药农并未采集收购黄花软紫草。因此，要想解决紫草野生资源短缺的问题，就应加大对其人工种植的研究，并制定政策，鼓励新疆紫草人工栽培。