叶 威, 李 强, 陈 颖, 胡 菲, 胡宇辰, 吴琴霞，曹福亮

(南京林业大学生物与环境学院，南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037)

银杏(Ginkgobiloba)叶含有黄酮和萜内酯等多种生理活性物质，对心脑血管疾病具有独特疗效，其在农业、加工业、药业等方面具有重要的地位[1]。银杏叶用林的培育已成为近十几年来银杏产业发展的重要内容，而高产量和高质量银杏叶与银杏的品种以及雌、雄株的关系密切[2]。

银杏雌、雄株之间在叶片大小、叶形、色素含量、内源激素、光合特性、黄酮和内酯等方面都存在差异[3]。金叶银杏是由南京林业大学培育出的新品种[4]，其叶片在4—5月就呈金黄色，因而具有重要的观赏价值。研究表明金叶银杏在5—6月是转色的关键时期[5]，金叶银杏色素含量与叶色密切相关[6]，其呈现金黄色的原因主要是由于叶中叶绿素的减少或黄色素如类胡萝卜素的增加[7]。袁斌玲等[8]对金叶银杏的扦插繁殖和盐胁迫下的黄酮代谢情况进行了研究，为金叶银杏的快速繁殖和开发利用奠定了基础。

提高叶用银杏种植园黄酮类化合物的产量可增加银杏产业的经济效益[9]。黄酮类化合物是植物特有的次生代谢产物，叶片黄酮的周年变化与光合色素及光合作用关系密切，而对于雌株、雄株和金叶银杏叶内的黄酮周年变化与光合变化之间的关系研究鲜见报道。本研究以普通银杏雌、雄株和金叶银杏嫁接树的叶片为试材，探讨银杏叶黄酮各成分的周年变化与光合色素及叶绿素荧光之间的相互关系，旨在了解黄酮类化合物在银杏叶片中的合成代谢规律，选育优良品种，确定银杏叶的合适采摘期，为银杏叶黄酮类化合物的代谢机制研究及金叶银杏资源开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

银杏叶采集于南京林业大学下蜀林场银杏种质资源圃(119.21°E，32.12°N)。选择相同生境下长势良好、无病虫害、管理一致，且有代表性的10年生普通银杏雌、雄植株实生苗和金叶银杏嫁接植株各10株。其中金叶银杏嫁接苗以湖北安陆地区芽变银杏母树上的芽为接穗，以上述普通银杏实生苗为砧木嫁接培育而成[4]。

从4月开始，每月中旬采集3种银杏植株的叶片，直到11月，共8次。其中相对叶面积的测定在4月测定4次。每次从植株同一高度的短枝上随机摘取大小均匀、叶色一致、无伤病的叶片。每种银杏每株分别采10片，共100片混合在一起，用冰盒立即带回实验室，洗净晾干后，其中15片用于叶绿素荧光及叶绿素含量的测定，剩余叶片分成3组，用于含水量和黄酮等成分的测定。

1.2 指标测定

将洗净晾干的银杏叶称取鲜质量(FW，记为WF)后，再于105 ℃杀青15 min，然后在65 ℃烘箱内烘干至恒定质量(DW，记为WD)，计算含水率。含水率=(WF-WD)/WF×100%。叶绿素含量测定参照李合生[10]方法。叶绿素荧光参数测定时，每种银杏分别随机取10片叶，采用CF Imager叶绿素荧光成像系统进行叶绿素荧光参数的测定。叶片在暗适应30 min后, 测定初始荧光(Fo)、最大荧光(Fm)和光系统Ⅱ最大光化学效率(Fv/Fm)；叶片充分光适应后，测定有效光化学效率(Fv′/Fm′)、光化学淬灭系数(qP)和非光化学淬灭系数(NPQ)，每个月测定1次。相对叶面积由叶绿素荧光仪测得。

黄酮苷成分含量的测定参照文献[8]方法：总黄酮含量(mg/g)=(槲皮素含量+山柰酚含量+异鼠李素含量)×2.51。

1.3 数据统计与分析

采用 Excel 2020 对数据进行处理，SPSS 21.0 软件进行方差分析和多重检验。每个指标测定3次重复。

2 结果与分析

2.1 银杏叶含水量和叶面积年动态变化

银杏1年中(4—11月)不同时期含水率的变化情况见图1。各银杏叶的含水率年动态变化趋势基本一致，都表现为年初期(4月)含水率最高，后整体呈下降趋势，在4—7月下降幅度较小，8—9月下降加速，在10月左右下降最快，到11月时，银杏叶片的含水率只有30%～40%。其中金叶银杏的含水率高于雄株，雌株与金叶银杏除了4、6、9、10月，其他月份没有明显的差异，雄株的含水率从6月开始都显著低于前两者，特别是在8—9月差异较大，9月分别比金叶银杏和雌株银杏降低了20.0%与16.6%。银杏叶面积周年变化见表1。银杏叶片从4月上旬到4月30日是叶面积快速生长期，4月17日比4月10日雌株、雄株、金叶3种银杏相对叶面积分别增加了1.48、1.68、1.58倍，4月30日比4月10日3种银杏的相对叶面积分别增加了2.72、3.36、4.27倍。5—6月为次级快速生长期，生长速度比4月要低，6—10月为缓慢生长期(平台期)，10月叶面积达到最高，10月比4月10日叶面积分别增加了4.18、5.43、5.78倍，11月叶面积降低(叶片干枯皱缩)。10月雌株银杏的叶面积最大，雄株次之，金叶银杏最小，但金叶银杏叶面积比雌、雄株更早地达到平台期(在6月)，雌、雄株在8月达到平台期。

表1 银杏相对叶面积周年变化

2.2 银杏叶色及光合色素含量动态变化

金叶银杏在4—5月为金黄色，特别是5月，黄色度更深，6月开始转绿，7月转绿完成，9—10月的叶色与雌株类似。从雌株和雄株的叶色变化来看，4—6月相差不大，但在9—10月雄株比雌株叶色转黄更早一些，甚至比金叶银杏还早(图2)。

从叶绿素含量[叶绿素a, Chla; 叶绿素b, Chlb, 总叶绿素，Chl(a+b)]变化来看，3种银杏叶绿素含量从4月开始上升，6—7月或8月 Chla达到高峰，然后急剧下降，9月又缓慢下降直到11月份的低点。方差分析表明，同一月份各银杏之间在4—8月光合色素含量存在显著差异(P<0.05)，9—11月3种银杏的色素差异变小(图3A—图3C)。

在5—9月，雌株银杏的Chla和Chlb及总叶绿素含量都显著高于雄株或金叶银杏的，特别是在4—6月，金叶银杏的叶绿素含量最低，如4月雌、雄株叶绿素a分别比金叶银杏高2.29和2.46倍，雌、雄株叶绿素b分别比金叶银杏高9.83和9.03倍，雌、雄株总叶绿素含量分别比金叶银杏高3.45和3.20倍。但金叶银杏叶绿素a和总叶绿素含量从4月(叶绿素b从5月)开始缓慢增加到6月，从6月到7月是金叶银杏色素快速增加的时期，也是金叶银杏由黄色转为绿色的关键时期，叶绿素到7月达到高点后一直维持到8月，然后快速下降到9月。8月Chla和Chlb及总叶绿素含量已经接近雄株，但仍低于雌株(图3A—3C)。

雄株与雌株银杏叶绿素含量在4月没有显著差异，在5—8月Chla和Chlb和Chl(a+b)都显著低于雌株(P<0.05)，是两者色素含量差异最大的时间段，如在6月雌株比雄株的Chla和Chlb及总叶绿素含量分别高0.47、1.77、0.94倍。9月后雌、雄株的色素差异变得很小(图3A—3C)。

从类胡萝卜素来(Car)看，在4—5月雌株的类胡萝卜素远高于雄株和金叶银杏的，在6—7月却相反，雌株的Car低于雄株和金叶的。而金叶银杏在6—8月的类胡萝卜素与雄株没有显著差异，但数值普遍高于雄株(图3E)。

从Chla/Chlb来看，金叶银杏的Chla/Chlb在整个观察期都高于雌株和雄株，特别是在4—7月，差值较大，如5月金叶银杏的Chla/Chlb分别比雌株和雄株高2.31和2.66倍(图3D)。总叶绿素/类胡萝卜素[Chl(a+b)/Car]金叶银杏在4—8月都低于雌株和雄株，10月后三者差异较小。雄株的Chla/Chlb在6—8月高于雌株(图3D)，而Chl(a+b)/Car低于雌株(图3F)。

2.3 银杏叶片叶绿素荧光参数的年动态变化

4—11月银杏叶片叶绿素荧光参数的年动态变化见图4。从叶绿素荧光参数的周年变化来看，银杏的Fv/Fm(最大光化学效率)为0.70～0.84。在4—7月逐渐增加，然后从7月开始又逐渐下降。金叶银杏与雄株、雌株之间(除了8月和10月)都没有显著差异(图4A)。从有效光化学效率(Fv′/Fm′)来看，雌株和雄株在4月最低，逐渐增加到6月(雌株)或7月(雄株)的高点，再逐渐下降至11月，雄株的Fv′/Fm′大部分月份都高于雌株(除6月、11月外)，特别是在8—9月存在显著差异；金叶银杏的Fv′/Fm′在4月、6月和7月都处于较高的水平，5月较低，7月后逐渐下降，但所有月份都高于雌、雄株，且与两者都存在显著差异(P<0.05),如 4月和6月金叶银杏比雌株分别高51.3%、44.3%，比雄株分别高7.4%、13.1%(图4B)。

从光化学淬灭系数(qP)来看，3种银杏的qP在4月最高，然后逐渐下降，到6—7月达到低点，然后又升高至8月，9月又有所下降，此后雌、雄株缓慢上升到11月，雌、雄株之间在9月存在显著差异，其他月份差异不显著。而金叶银杏的qP从9月一直呈下降趋势，到11月达到最低点，10—11月与雌、雄株存在显著差异(图4C)。各银杏的非光化学淬灭系数(NPQ)的年动态变化与qP的变化不一致，雌、雄株在4—5月最高，然后下降到6月，此后雄株缓慢升高到11月，而雌株在10月有所下降，11月又回升至近雄株的水平，在7—9月雌株银杏的NPQ显著高于雄株(P<0.05)。金叶银杏4月的NPQ最低，然后开始缓慢上升到9月达到最大值，10月再次下降，11月又有所回升，此阶段与雌株的变化相似。总体来讲，金叶银杏的NPQ都低于雌、雄株的，特别是在4—6月，如4月雌株和雄株的NPQ分别比金叶银杏高5.08和4.62倍，6—9月的差距缩小(图4D)。

2.4 3种银杏叶黄酮成分含量的年动态变化

雌株银杏的槲皮素(quercetin, Que)含量在5月份到最高(高于雄株和金叶)，然后下降至8月，9月有所回升，后又出现下降。雄株银杏的槲皮素含量在4月最高，然后下降到6月，维持到10月略有上升后11月又下降，在7—10月显著地高于雌株，如8月比雌株高了101.7%。金叶银杏的槲皮素含量5—7月下降，此时都低于雌、雄株，如7月槲皮素含量比雌、雄株分别低53.4%和99.3%，从7月开始上升到9月，此时与雄株含量没有显著差异，然后10月下降，11月有所回升(图5A)。

雌株银杏在4月山柰酚(kaempferol, Kam)含量达到最高(此时比雄株和金叶的高)，此后呈波浪形变化，在7月和9月出现峰值，在8月和11月出现谷值。而雄株的山柰酚含量4—5月稍有降低，尔后随着月份增加呈上升趋势，其中在9月达到最高峰，分别比雌株和金叶银杏高46.9%和19.7%，10—11月稍有降低。金叶银杏的山柰酚含量在4—6月下降，此时低于雌、雄株，从6月开始上升到8月达到高点，然后开始下降，11月有所回升(图5C)。

银杏叶中异鼠李素(isorhamnetin, Iso)含量随着月份增加表现也不一致。雌株银杏4—6月下降，6—8月逐渐上升，维持到10月后又出现下降。雄株的异鼠李素从5月后开始上升到9月达到最大值，9月后稍有下降，10—11月大幅下降，9—10月显著高于雌株，如9月雄株的异鼠李素比雌株高46.0%。金叶银杏异鼠李素从4月下降到6月，然后持续上升至9月，其含量接近雄株此时的水平，9—11月的变化同雄株一致(图5B)。

雌株银杏的总黄酮(total flavonoids, total fa)含量变化呈波浪形，即在6、8、11月处于谷底，7、9月处于谷峰，除4—5月高于雄株外其他月份都小于雄株，特别是在8、9月分别比雄株低62.6%和38.5%。雄株银杏的总黄酮含量从5月一直上升到9月的高峰，都远高于同时期的雌株和金叶(除8月外)的，此后下降至11月。金叶银杏的总黄酮含量从4月开始下降至最低的6月，然后从6月持续上升至9月的最高值，9月金叶银杏的总黄酮比雄株低9.8%，随后开始下降至11月(图5D)。

2.4 银杏叶各指标间的相关性

银杏叶各指标间的相关性分析见表2。在整个4—11月的周年变化中，银杏的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素及类胡萝卜素之间都存在显著和极显著的正相关(除雌株的类胡萝卜素与叶绿素b之间)(P<0.01)。在黄酮成分槲皮素、山柰酚、异鼠李素与总黄酮之间都存在着极显著的正相关(P<0.01)。在黄酮成分与光合色素的关系中，雌株的槲皮素与叶绿素a之间，雄株的槲皮素与叶绿素a、b及总叶绿素间之间都存在显著的正相关(P<0.05)；而雄株的山柰酚与叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素及类胡萝卜素之间存在极显著的负相关。另外，雌株的类胡萝卜素与槲皮素及总黄酮呈极显著正相关，而金叶银杏的类胡萝卜素与槲皮素、异鼠李素及总黄酮呈显著的负相关(P<0.05)。

表2 银杏叶各指标间的相关性分析

黄酮成分与4个叶绿素荧光参数的关系中，雌株的总黄酮与之关系不密切(除NPQ外)，但雄株的Fv′/Fm′与槲皮素呈显著正相关却与山柰酚呈显著负相关，金叶银杏的Fv′/Fm′与槲皮素、山柰酚和总黄酮呈显著或极显著负相关；qP与雌株和金叶银杏的槲皮素呈极显著正相关，而与雄株银杏的山柰酚、异鼠李素及总黄酮呈显著负相关。NPQ与雌株银杏的槲皮素、总黄酮及与金叶银杏的山柰酚和总黄酮之间存在极显著正相关(P<0.01)；相反，雄株的NPQ与山柰酚和异鼠李素及总黄酮呈显著负相关(P<0.05)。

雌株银杏的含水率与光合色素、黄酮成分都呈极显著正相关，而雄株银杏的含水率与槲皮素、山柰酚呈显著负相关；金叶银杏的含水率除与类胡萝卜素、异鼠李素显著相关，与其他光合色素和黄酮成分关系不显著。

3 讨 论

银杏雌、雄株及芽变品种金叶在1年(4—11月)的生长周期中，其叶色、生长及色素含量、叶绿素荧光参数及黄酮成分及含量都出现了不同的变化特点。从含水量和相对叶面积变化来看，雄株银杏叶的含水量在整个测定期都普遍低于雌株和金叶银杏的，特别是在6—10月的夏季高温时期，雄株的含水量与雌株和金叶银杏相比呈现显著性差异。含水量的变化与雌株的光合色素、黄酮的成分都呈极显著正相关。He等[11]研究指出，缺水状况下，雌株银杏含水量较高，生长更好，水分亏缺显著降低银杏叶绿素的含量[12]，这与本研究的结果相一致。从相对叶面积的变化来看，雌株银杏的相对叶面积整体大于雄株和金叶的，这与江德安等[13]研究结果一致，说明在南京地区，夏季正午高温(35～38 ℃)对雄株生长的影响高于雌株和金叶。

在银杏生长的周年变化中，雌株银杏叶绿素含量总体上远高于雄株与金叶银杏，特别是6—8月高温的夏季差异加大，如6月雌株总叶绿素含量比雄株高0.94倍。7—9月银杏的叶绿素b出现急剧下降，比叶绿素a下降幅度大，这一结果与盐胁迫下小麦的叶绿素b变化一致[14]，说明在胁迫情况下，叶绿素b较叶绿素a更易降解。但从银杏的类胡萝卜素和Chla/Chlb比值来看，雄株和金叶银杏在6—7月有较高的类胡萝卜素，可以通过类胡萝卜素抵御7—9月对叶绿素降解造成的伤害，总体来看7—9月的夏季高光强、高温胁迫引起了银杏叶绿素特别是叶绿素b的降解，但雌株的总色素高于雄株和金叶，因而比雄株和金叶抵抗能力更强一些。

叶绿素荧光参数Fv/Fm是指植物潜在的最大光合能力,而qP反映的是PSⅡ天线色素吸收的光能用于光化学电子传递的能力，qP越大PSⅡ反应中心电子传递活性越强。参数Fv′/Fm′是指植物光合作用中实际光能转化为稳定化学能的能力，参数NPQ 反映了以热耗散形式散发的能量，即能量转化为热能消耗的效率，是植物耐光氧化能力的指标[14-15]。本研究中，3种银杏在夏季高温情况下，雌株银杏的Fv/Fm在8月、Fv′/Fm′在7—9月都显著低于雄株和金叶。相反，雌株银杏的qP在9月高于雄株，NPQ在7—9月都高于雄株和金叶。这些结果与有关‘南林895’杨、梭梭(Haloxylonammodendron)及银杏在环境胁迫下的荧光参数变化的研究结果相似[11，16-17]，表明在夏季的高温情况下，雌株银杏吸收的光能更多以热能耗散的形式释放，其用于热耗散的能量高于雄株和金叶，尽管雌株比雄株和金叶也有较强的PSⅡ反应中心电子传递能力(qP)，但体现在热耗散的能量(NPQ)更多一些，因而导致8—9月雌株的有效光化学效率(Fv′/Fm′)低于雄株和金叶，但从抗性能力来讲，雌株可以通过增强热耗散减轻高光强的胁迫和生长抑制，因而具有比雄株和金叶更强的抗氧化能力，说明银杏在胁迫情况下，雌株较雄株有更强的抗逆性，前人研究结果也证明了这一点，雌株银杏比雄株银杏更抗衰老[18]。

银杏培育的主要目的之一是收获高产量和高黄酮含量的叶片，树龄、性别、环境条件、采收期都影响着黄酮成分和叶产量。前期有学者研究表明，2～4年生的实生苗叶片黄酮含量最高，是叶用林培育的最适树龄[19]。银杏叶最佳采叶期，山东地区为5—10月[19]，徐州地区以8月下旬采摘为宜[20]，甘肃地区以10—11月较好[21]。本研究中，3种银杏的槲皮素、山柰酚、异鼠李素及总黄酮含量1年中分别在4—5月和9月达到高点，槲皮素的最高点在4—5月，后三者的最高点都在9月，因此适宜采叶期在9月，基本与前人研究结果一致。在雌、雄株黄酮含量方面，有研究表明，徐州地区4—5月叶片类黄酮含量雄株>雌株，其他月份均为雌株>雄株[20]。嫁接的银杏树雌、雄株间叶片黄酮含量差异不显著[22]，雌株和雄株之间的黄酮含量不存在显著差异[23-24]。但本研究中，雄株与金叶银杏的黄酮成分在9月均高于雌株，且三者之间存在显著差异，因而雄株和金叶银杏更适合用于叶用林培育，这些结果与上述研究结果不一致，而与杨伟丽等[21]的研究结果一致，这可能与银杏品种、树龄、环境、生长条件不同有关。邢世岩等[25]认为雄株和雌株群体中都有优良叶用资源，但雄株内筛选出高产叶用品种的可能性更大。

本研究中，雄株和雌株及金叶银杏在黄酮含量上出现的差异可能与光合色素及叶绿素荧光的差异有关。6—8月雌株的叶绿素含量远高于雄株和金叶，光合性能也优于雄株和金叶，因而雌株更耐夏季的高温和缺水，即6—8月雌株吸收的光能主要用于抵抗高光强等胁迫维持生长。黄酮等次生代谢物的产生与逆境有关，逆境条件有利于次生代谢物的合成[26]，在6—8月雄株和金叶的色素含量较低，光合性能下降，吸收的光能主要用于合成逆境胁迫物质包括黄酮类化合物来抵御高光强和水分胁迫。从叶绿素和黄酮的相关性来讲，雄株的叶绿素及类胡萝卜素与槲皮素之间存在极显著正相关，而与山柰酚呈显著负相关，与总黄酮和异鼠李素关系不密切；而雌株的类胡萝卜素与槲皮素及总黄酮，叶绿素a与总黄酮之间存在极显著正相关。可以看出类胡萝卜素与黄酮代谢关系更密切些。

本研究中金叶银杏由于是芽变品种，嫁接后的叶色变化在4—6月不同于雌、雄株，4—6月的叶绿素含量均比雄株、雌株银杏低，导致金叶银杏在4—6月的叶片呈金色，6—7月是金叶银杏叶绿素快速增加的时期，也是金叶银杏由黄色转为绿色的关键时期，这些结果与相关研究[4-5,27-28]的结论一致。但到6月完成转色后，其光合、黄酮代谢的变化接近于雄株，其黄酮合成的能力高于雌株，因此金叶银杏是一个较为优良的变异品种，具有重要的研究和培育前景。

综上所述，银杏在1年期内的生长、光合色素、叶绿素荧光及黄酮含量出现了不同的变化，从光合性能和抗逆性来讲，雌株较雄株和金叶银杏更耐夏季的高温和缺水，延迟叶片衰老，而雄株和金叶银杏黄酮含量高于雌株，在叶用方面更有价值。银杏叶的最佳采收期在9月。金叶银杏除了有重要的观赏价值，还有非常重要的经济价值，是具有开发潜力的新品种。