邓斌

安顺市人民医院 贵州 安顺 561000

在院内感染的研究中，一个很重要的问题，就是如何确定感染源和传播途径只有明确病原菌的感染方式，才能采取有效的预防和控制措施，因而对微生物的鉴定和分类就不能仅限于种间水平，还必须深入到种内即亚种，以便更精确了解其流行病学意义。以往真菌的分型方法主要嵌赖于血清型、酵母杀菌系统，抗性谱。等生物学方法，但这些方法易受环境及人为因素的影响而缺乏满意的稳定性和重复性。另外，生物学方法也不能精细分型，分辨率低，影响了其流行病学及致病力的研究。近年来，分子生物学技术已广泛应用于细菌病毒基因水平的研究。目前已有一些分子生物学技术的方法如限制性内切酶多态性分析(RFLP)、脉冲场电泳核型分析(PFGE)、基因探针杂交分析(SHA)及随机引物扩增DNA—PCR多态性分析(RAPD)等应用于真菌研究，尤其是念珠菌基因分型的研究[1-4]。这些方法与生物学分型方法相比，具有良好的稳定性，重复性及高分辨率，现将其有关研究动态综述如下。

1.DNA基因分型对于流行病学研究具有重要的指导意义

无论采用何种分型方法，都必须有明确的调查目的，即(1)确定爆发流行；(2)确定传播途径，评价预防措施；(3)监测某些有害致病菌。这些分型方法的基本原理是，相同的菌株具有相同的DNA指纹图谱，而不同菌种，其DNA指纹图谱也不同如果病人自身不同时期或不同解剖部位分离出相同的基因型菌株，且病人之间的基因型不同，多属于内源性感染。定植株与感染株基因型相同，且定植株先于感染株，也提示为内源性感染。如果从不同病人身上、工作人员及环境中同时分离出相同的基因型菌株，则多为交叉感染。而这些结论都必须依靠良好稳定性、重复性及高分辨率的分型方法[5-7]。

2.常用的几种分型方法

限制性内切酶多态性分析(RFLP)：就是对DNA分子用不同的内切酶处理后，通过琼脂糖电泳所产生的DNA片段的大小进行分析，便可推论出所用酶在该DNA分子中的切点数目以及它们的位置关系，了解菌种在基因水平上的相同或不同，从本质上区别种问差异用限制性内切酶分析产生的基因多态性称为RFLP1987年Scherer等首先将这种方法用于念珠菌的研究。用EcoRl对6株白色念株菌DNA进行酶切分析，可见到许多条带(>100)，最明显的带型有3条对同一株菌反复酶切分析，带型不发生改变，证明其具有良好的重复性。又将同一株菌大约传代420次后酶切分析，传代前后具有相同的酶切图谱，显示了良好的稳定性预测该方法在研究真菌感染方面将具有广阔的应用前景。目前用于真菌研究的限制性内切酶已选20余种，常用的有EcnRJ、Mspl、Hindi、BanHI等。EcoRI价格低，来源方便，是一种最常用的酶，其对白色念珠菌酶切可产生4～16个基因型。Vazqauez等采用EcoRI和Mspl对白色念珠菌进行酶切。EcoRI酶切产生6个基因型，MspI产生6个基因型，两种酶联合分型为17个基因型，说明联合酶切可提高分辨率。Delabesse等比较了RFLP和PFGE两种方法，Rea—gan等比较了RFLP和SHA两种分型方法对相同菌株的分型图谱，认为RFLP分别比电泳核型(EK)、SHA所产生的基因型多，分辨率高，更能精细区别不同来源的菌株。RFLP不需要特殊的实验仪器，一般实验室条件即可完成。但RFLP需提取大量完整的DNA，同时，电泳带型易受DNA提取过程、电泳条件的影响，是其固有的缺点[8-12]。

脉冲场电泳核型分析(PFGE)：这也是常甩的分型方法。一般情况下，普通琼脂糖凝腔电泳只能分离50kb以下的DNA片段，且它是单方向电场，较大的DNA分子容易陷在凝胶孔里而停滞，而PFGE至少有两个方向的电场，在设定的时间内交替变换，使大分子DNA在行进中不断改变tl己的形态及迁移方向，从而绕过细小的凝胶孔隙得以分离。PFGE可分析2Mb以上的DNA分子，用PFGE得到的全基因染色体组型称为电泳核型(EK)对病原体而言，EK分析特别适用于基因组含若干条染色体的低等真核微生物或原虫，它无需用限制性内切酶消化和探针杂交，就可方便地从EK的差异区别不同的菌种。念珠菌有4～10条染色体。EK分析带型清晰易辨，容易比较，能够区别种间差异，是一种较好的流行病学研究方法，但与其它方法相比，它需要较昂贵的仪器，DNA的制备及PFGE过程也均较费时[13-15]。

基因探针杂交分析(SHA)：目前用于真菌：尤其是念珠菌感染研究的基因探针.包括全染色体基因探针、线粒体基因探针、白色念珠菌肌动蛋白基因探针和白色念珠菌2.9kb、27A、C3a、pBD40特异性探针等。在菌种的鉴定上，基因探针敏感性及特异性高，带型简单易解释，但在种间分型的应用上，不如RFLP和EK方法分辨率高。目前还没有人工合成探针，且DNA抽提、酶切、片段标记等制备过程繁琐，不适用于临床上大量标本的流行病学调查[16-19]。

随着PCR技术的广泛应用，随机引物扩增PCR多态性分析(RAPD)是近年来发展起来的一种新的种间分型方法。通过选择单条或多条片段长度为8～10个碱基寡核苷酸引物，用PCR的方法对标本底物扩增，经琼脂糖电泳分离出不同长度的片段构成PCR指纹图谱。Belkum对白色念珠菌的RAPD、EK、EcoRI和HindI酶切的RFIP、27A探针的基因图谱进行比较分析显示，RAPD能分辨13个基因型，而其它方法分别产生8～12个基因型，因而认为RAPD具有较高的分辨率。RAPD最明显的优点是不需要抽提大量的DNA，从临床标本中可直接检测，并可同时进行种间鉴定和种内分型，而其它方法则需要在鉴定出种属的基础上再分型，所以RAPD更快速、简便，是一种具有发展前途的种间分型方法[20-23]。

3.分子生物学技术在真菌流行病学调查方面的应用

Pitter等用EK法研究了致病酵母菌在危重病人寄生的纵向和横向模式。他们在6个月内前瞻性地从29例危重病人身上分离出322株念珠菌，这些菌株分离自多个解剖部位不同时期的同一部位，每一病人分离出的菌株具有同一种EK型，即使取自不同部位或经过一段时间(长达140天)也是如此，其中8例患者发生真菌菌血症，其定植株与感染株的EK型相同.且定植先于感染Reagan等对骨髓移植和血液病患者进行调查，对16例念珠菌感染病人的分离株进行分析，其中15例病人定植株与感染株有相同的基因型，而10／13(81)病人之间具有不同的基因型。以上研究资料证明危重病人真菌感染多由内源性感染引起.感染源来自病人自身定植菌株[24]。

虽然许多院内念珠菌感染是由内源性感染引起，但真菌外源性感染也是不可忽视的问题。Sanchez等“对一所医院重点监护室(ICU)病区和骨髓移植病区的89例患者进行了前瞻性调查，5例病人发生近平滑念珠菌感染，这5例病人入院时均无近平滑念珠菌定植。分别从4名工作人员的手及环境中分离出该致病菌。用RFLP分析表明，4例病人、3名工作人员及环境中具有该菌相同的基因型，说明近平滑念珠菌感染是由间接接触传播的。Girardin等对2例侵袭性曲霉菌感染病人分离株及环境中分离株用Southern斑点印迹杂交分析显示.病人感染与空气污染有关，空气传播可能是曲霉菌感染的传播方式。Voss和Romano等分别对两起外科ICU病区念珠菌爆发感染进行调查.从病人不同感染部位、病人使用物品、工作人员手和咽部分离出白色念珠菌。用RFLP分型分析，认为爆发流行是因间接接触引起的交叉感染，工作人员的手是传播媒介，提示洗手是预防真菌交叉感染必不可少的措施[25-26]。

对某些特定真菌进行基因水平分型是流行病学研究的重要工具.它将对真菌感染的预防和控制具有重大指导意义。今后的研究方向应对分型方法统一实验条件和操作方法，并建立统一的分型标准。