王贝 李芳

（武汉华夏理工学院生物与制药工程学院，湖北 武汉 430223）

1 PHMB-HCl研究现状

随着社会的发展，杀菌消毒越来越受到人们的重视，在日常生活中被人们广泛运用。医院内的医疗设备，包括纱布块、湿化瓶、手术剪、钢板等，均需要严格检查、清洗、消毒。在食品、药品加工过程中，污染物很容易在人员、设备、原材料、半成品和表面之间转移，为了防止交叉污染，加强食品、药品安全性，操作者必须确保对手、表面、器具、设备等进行适当的杀菌消毒。做好杀菌消毒是我们生活中不可或缺的一部分。

早在半个世纪前，人们就已经发现了胍类消毒剂，并在生活中广泛运用。胍基消毒剂是一种阳离子表面活性剂，有去污、杀菌和消毒等功效，主要用于物品、手和环境的清洗和消毒，还可以和酒精混合使用，以提高杀菌效果［1］。常用的胍类消毒剂有乙酸氯己定、聚六亚甲基双胍和葡萄糖酸氯己定等。因为胍类消毒剂刺激性低，无腐蚀性，且稳定性好，所以在医院应用广泛。其中，聚六亚甲基双胍盐酸盐（PHMB-HCl）是由美国ICI公司于1970年开发的一种环保高分子聚合物杀菌剂，又名Reputex20。PHMB-HCl是一种能杀死革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、酵母菌等的广谱抗菌素，是具有较强抗菌作用的细胞膜活性抗菌剂；还可作为一种絮凝剂，驱除海藻，用于游泳池、工业废水等的消毒；PHMB-HCl还可在食品工业、个人护理、化妆护肤品等领域广泛应用［2］。

PHMB-HCl含量测定常用的方法有非水滴定法、紫外分光光度法、比色法、褪色光度法等，由于消毒剂里还有其他成分，会影响含量检测，故无法使用非水滴定法检测消毒剂中的双胍含量。紫外分光光度法测量同一样品时的线性关系虽良好且稳定，但当测量不同厂家的PHMB-HCl样品时开始出现明显的差异。比色法测定PHMB含量，操作相对复杂，而且标准曲线的线性相关系数较低。褪色光度法不易被其他基团及原料所干扰，能更准确地反映消毒剂的质量与杀菌效果。与紫外分光光度法相比，褪色光度法测量时线性关系同样良好，且准确性和精密度更高［3］。使用褪色光度法时，在缓冲液中曙红Y的存在形式是阴离子，而PHMB-HCl的存在形式是阳离子，它们因疏水作用、静电作用和电荷转移等影响，而形成离子缔合物，使溶液的颜色变淡，故可以使用分光光度计来测量吸光值，体现颜色的改变。综上所述，本研究选用具有较高选择性的褪色光度法。

2 试验部分

2.1 仪器与试剂

电子天平（上海花潮实业有限公司，型号：FA2204CT）；分析天平（上海海康电子仪器厂，型号:FA214）；紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司，型号：TU-1900）；水浴锅（国华电器有限公司，型号：HH-2）；可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司，型号：722型）。

醋酸钠；水溶性曙红Y；浓盐酸；正丁醇；无水乙醇；醋酸（以上试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司）；PHMB-HCl待测样（实验室自制）；PHMB-HCl对照品（纯度98%，购自长沙研帮化工科技有限公司）。

2.2 最佳波长的选择

量取1mL 1.2 mg/mL显色剂，与pH值为4.2的缓冲液制成显色缓冲剂10 mL，再加入0.06 mg/mL PHMB-HCl标准溶液1 mL，于25 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至25 mL，充分混匀，显色40 min，待测。空白对照选用上述显色缓冲液10 mL和蒸馏水配成的25 mL溶液，显色40 min，待测。用紫外可见分光光度计在450～600 nm波长下对待测液进行光谱扫描，确定最大吸收波长。

2.3 缓冲液pH值的选择

保持显色剂浓度和用量、标准品浓度和用量、显色时间、醋酸钠溶液的物质的量浓度不变，仅通过改变所加冰醋酸的体积来改变缓冲液的pH值。具体选用1.2 mg/mL的显色剂1 mL，0.06 mg/mL的标准溶液1 mL，显色40 min，物质的量浓度为0.2 mol/mL的醋酸钠溶液。通过改变缓冲液pH值来影响吸光度，用蒸馏水做空白对照，考察缓冲液pH值对含量检测的影响［4］。分别测定pH值为4.0、4.2、4.4、4.6、5.0、5.5的待测液在517 nm和545 nm下的吸光度。

2.4 显色剂浓度的选择

保持标准品浓度和用量、显色时间、缓冲液pH值、显色剂用量不变。具体选用pH值为4.4的缓冲液、0.06 mg/mL的标准溶液1 mL，显色40 min，显色剂1 mL。用蒸馏水做空白对照，分别测定浓度为0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL、1.4 mg/mL、1.6 mg/mL、1.8 mg/mL、2.0 mg/mL、2.2 mg/mL、2.4 mg/mL、2.6 mg/mL、2.8 mg/mL、3.0 mg/mL的显色剂1 mL配制的待测液在517 nm和545 nm下的吸光度，考察显色剂浓度对含量检测的影响。

2.5 显色剂用量的选择

保持标准品浓度和用量、显色时间、缓冲液pH值、显色剂浓度不变。具体选用pH值为4.4的缓冲液、0.06 mg/mL的标准溶液1 mL，显色40 min，显色剂1.2 mg/mL。用蒸馏水做空白对照，分别测定浓度为1.2 mg/mL的显色剂0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL配制的待测液在517 nm和545 nm下的吸光度，考察显色剂用量对含量检测的影响。

2.6 显色时间的选择

保持显色剂浓度和用量、标准品浓度和用量、溶液pH值不变，仅改变显色时间来进行含量检测。具体选用pH值为4.4的缓冲液、0.06 mg/mL的标准溶液1 mL、1.2 mg/mL的显色剂1 mL，仅通过改变显色时间来影响吸光度。用蒸馏水做空白对照，分别测定显色10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、100 min后的待测液在517 nm和545 nm下的吸光度，考察显色时间对含量检测的影响［5］。

2.7 线性关系

保持显色剂浓度和用量、标准品用量、显色时间和溶液pH值不变，仅改变标准品浓度来进行含量检测。具体选用pH值为4.4的缓冲液、1.2 mg/mL的显色剂1.2 mL、显色40 min来进行含量测定。分别测定浓度为0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、0.12 mg/mL、0.16 mg/mL、0.20 mg/mL、0.24 mg/mL、0.28 mg/mL的PHMB-HCl标 准 液1 mL在517 nm和545 nm下的吸光度。以517 nm和545 nm下的吸光度之和为纵坐标、样品溶度（mg/mL）为横坐标，制作标准曲线，得到线性关系、线性回归方程与R值。

2.8 准确性试验

选用实验室合成的PHMB-HCl半固体产品作为供试品，标准PHMB-HCl作为对照品。按供试品与对照品的比值为1∶1、1∶2、2∶1来计算加入供试品和对照品的质量，不同比值的溶液均配制3份，以减少误差。按照最优含量测定条件来进行试验，即选用pH 4.4的缓冲液、1.2 mg/mL 1.2 mL的显色剂、40 min显色时间来进行含量测定。以蒸馏水为空白对照，分别测定545 nm和517 nm时的吸光度。

2.9 精密度试验

称取0.04 g供试品，加入60 mL温热的蒸馏水，使供试品固体溶解，冷却后加蒸馏水定容至100 mL，移取1 mL供试品溶液于25 mL容量瓶，并加蒸馏水定容至25 mL。选用pH 4.4的缓冲液、1.2 mg/mL的显色剂1.2 mL、1 mL稀释后的供试品溶液，配制待测液，显色40 min后，分别测定在517 nm和545 nm下的吸光度。重复以上步骤6次，共进行6次含量检测。

3 结果与分析

3.1 最大吸收波长的确定

光谱扫描结果如图1所示。当波长为545 nm时显示最大吸收峰，吸光度为0.176，此时曙红Y与胍基结合形成离子缔合物。当波长为517 nm时显示最低谷，吸光度为负值，为-0.183，此时发生褪色反应。因517 nm和545 nm两处所对应吸光度的绝对值之和最大，故确定用于检测的波长为517 nm和545 nm。

3.2 缓冲液pH值的确定

不同pH值的缓冲液所对应的测定结果如表1所示。

当pH值较小时，曙红Y中的苯酚羟基与氢离子结合，较难形成大的阴离子，抑制了曙红Y的静电作用力，褪色现象不明显；当pH值较大时，曙红Y的褪色作用反而减小，也不能与PHMB阳离子很好地缔合。当PHMB溶液的pH值不同时，曙红Y可以以4种形式存在：H3L+、H2L、HL-、L2-，当PHMB溶液的pH值为4.4时，L2-是溶液中主要存在的阴离子，因此可以与PHMB阳离子结合，发生褪色反应。并且，当pH值为4.4左右时，吸光度之和最大。因此，最终确定含量测定时缓冲液的最优pH值为4.4。

3.3 显色剂浓度的确定

显色剂浓度的选择结果如表2所示，显色剂浓度在1.2～1.6 mg/mL和2.4～3.0 mg/mL区间内吸光度之和较为稳定。但由于在2.4～3.0 mg/mL区间内吸光度之和过大，线性关系不稳定。当显色剂用量为1.2 mg/mL时，所对应的吸光度之和已经能够呈现良好的线性关系，故本试验确定含量测定时显色剂最优浓度为1.2 mg/mL。

表2 显色剂浓度的选择

3.4 显色剂用量的确定

显色剂用量的选择结果如表3所示，吸光度之和随着显色剂用量的增大而增大。当显色剂用量偏少时，不能充分引起PHMB-HCl发生显色反应。当显色剂过量时，易引起灵敏度的降低，为保证含量检测结果的准确性，并同时满足当吸收波长之和为0.2～0.8时，线性关系最佳且稳定。故本试验最终确定含量测定时显色剂的最优用量为1.2 mL。

表3 显色剂用量的选择

3.5 显色时间的确定

显色时间的选择结果如表4所示，当显色时间为40～60 min时，吸光度之和趋于稳定，但若继续延长显色时间，溶液会慢慢析出沉淀，导致溶液稳定性变差［6］。故试验最终确定选用40～60 min的显色时段来进行含量测定，其中最优的显色时间为40 min。

表4 显色时间的选择

3.6 线性关系结果

线性关系结果如表5和图2所示，得到方程y=1.082 7x+0.464 9，线性相关系数R2为0.995 6，表明PHMB-HCl在0.00～0.28 mg/mL具有良好的线性关系。

表5 标准品的线性关系

图2 标准品的线性关系

3.7 准确性试验结果

计算545 nm和517 nm下的吸光度之和，结果如表6。用计算出的吸光度之和，结合图2的线性回归方程式，计算出PHMB-HCl样品溶液浓度C1（mg/mL）。实测值m（g）按式（1）计算，Y是吸取未知溶液的体积（mL）。

经计算，结果显示，回收率为89.21%～95.90%，平均回收率为94.05%，RSD为2.13%（n=9）。测定结果准确性良好，符合分析要求，能满足PHMBHCl的含量测定要求。

3.8 精密度试验结果

精密度试验结果如表7所示，相对标准偏差为2.98%（n=6），精密度良好，符合分析要求。

表7 PHMB-HCl含量测定方法的精密度试验结果

4 结语

PHMB-HCl是胍类消毒剂的一种，其杀菌效果好，合成工艺也不复杂，在生活中被广泛使用。在PHMB-HCl的含量测定中，褪色光度法具有较大的优越性，具有较好的检测专一性，在测量时不易受其他基团的影响，更能反映双胍基团的含量。本研究通过多次单因素试验，最终确定了最优的PHMB-HCl含量测定条件为1.2 mg/mL 1.2 mL的显色剂、pH为4.4的缓冲液、显色40 min。采用优化后的条件测量产品中PHMB含量时，标准曲线线性关系良好，该含量测定方法可用于供试品中PHMB-HCl含量的测定，适用于各类消毒剂中PHMB-HCl含量的测定。

但在测量复方消毒产品时，不能很好区分开PHMB和PHMG［7］。褪色光度法更适用于PHMB或PHMG单方的测定，当测定复方化学消毒剂时，需要通过HPLC区分PHMB和PHMG。因此，对于不同的消毒剂进行含量测定时，应根据消毒剂各成分的特点进行含量分析方法的选择。