用于疫苗温度标签的共轭二乙炔类单体

2022-11-19白杏茹朱光明郝瑜佳

包装工程 2022年21期

白杏茹，朱光明，郝瑜佳

（西北工业大学化学与化工学院，西安 710129）

随着我国冷链物流以及疫苗行业的快速发展，尤其是自2019 年末新型冠状病毒爆发以来，疫苗的需求量激增，以至于应用于疫苗温度监测的疫苗温度标签逐渐成为人们关注的对象。它用于反映疫苗受环境中热和紫外线的影响程度，并据此评估疫苗的有效性，可提高疫苗的利用率。疫苗作为一种特殊的生物制品，主要由异体蛋白物质、多糖物质等具有生物学活性的物质构成，疫苗冷链监测需要注意的指标有温度、湿度、光照、化学反应和震动等多个因素[1-2]。在储存及运输过程中温度和紫外线是影响疫苗有效性的主要因素，大部分疫苗的储存温度约为2～8 ℃。为了保障预防接种的安全性和有效性，储运疫苗制品必须采用全程冷链的方式[3-4]。国内现有的疫苗冷链监控技术主要分为数据采集技术和数据传输技术，其中数据采集技术主要有时间-温度记录仪和时间-温度指示器（Time-Temperature Indicator，TTI）[5-7]。时间-温度指示器是一种用于实时监测食品、药物等产品安全性的新型指示剂，也可称为时间温度标签，分为扩散型TTI、酶型TTI[8-10]、微生物型TTI[11]、聚合型TTI[12]。另外，化学型TTI[13-15]也是近年来研究的热点，其中，基于亚甲基蓝的衍生物N，N，N'，N'-四甲基-N10-Boc-吩噻嗪-3,7-二胺，在加热时呈现出从无色到蓝绿色的不可逆变化，溶解于各种混合烷烃溶剂中的螺吡喃化合物也具有光致和热致变色效应[16-17]，苯酚的氧化褐变导致的颜色强度随时间和温度的变化也可作为微加工水果的微生物质量评估[13]。

目前，疫苗冷链最常用的TTI 是聚合物型疫苗温度标签[18]，主要活性成分为共轭二乙炔类单体[19-20]。共轭二乙炔类VVM[21-23]的产生机制来源于某些共轭二乙炔类单体以可预测和不可逆的方式进行固相聚合反应。在视觉上，共轭二乙炔类单体在热与紫外的环境中可产生明显的颜色变化[24]，通过将它的变色时长与宿主产品的保质期在同一环境条件下进行匹配，来指示宿主产品的有用货架寿命。由于不同宿主产品的储存环境不同、变质期限不同，可以通过改变共轭二乙炔单体的反应性来提高宿主产品与指示剂的时间温度参数紧密匹配的能力[25]。另外，由于大多数共轭二乙炔类单体在合成后立即显示出反应性，所以需要在加工和运输过程中将其失活，然后在特定时间下将其激活，这些都为指定的共轭二乙炔类单体作为VVM 提供了商业应用的可能性。

1 共轭二乙炔的固相聚合机理

1.1 初步探索

Wegner[26-27]通过电子自旋共振（ Electron Spin-Resonance Spectroscopy, ESR）揭示了共轭二乙炔的固相聚合中存在特征自由基，同时对共轭二乙炔的聚合提出了2 种定性方案，一种方案涉及卡宾物质A 的初始生成，其通过1，4-加成反应产生双键、叁键共存的聚合物链（PDA）。另一种方案涉及自由基物质B 的初始生成，其通过1，4-加成反应产生丁三烯形式的聚合物链（PBT）[28]，如图1 所示A、B。共轭二乙炔固相聚合的阶梯模型，单个分子排列成梯形结构，共轭三键形成梯级，取代基形成侧链阶梯（如：取代基有氢键），见图2[29]。

图1 共轭二乙炔2 种可能的中间体结构[28]Fig.1 Two possible intermediate structures of conjugated di-acetylenes[28]

图2 Wegner 等[29]提出的共轭二乙炔固态聚合阶梯模型Fig.2 Wegner G ladder model for the solid-state polymerization of diacetylenes[29]

1.2 卡宾机理

1972 年，Takeda 等[28]根据2，4-己二炔-1，6-二醇-双（苯基氨基甲酸酯）（HDDPU）的紫外聚合吸收光谱中观察到的中间体，得出活性链末端可能具有自由基或卡宾结构。1976 年，Eichele 等[30]通过在室温下观察部分聚合晶体的三重态ESR，表明卡宾位于非扩散聚合物链末端，他们认为这是证明共轭二乙炔固相聚合机理是卡宾机理的强有力的证据，但不能表明聚合反应中的活性物质一定是卡宾结构。此后，Wegner 等[31]基于光谱观测，认为共轭二乙炔聚合就是通过卡宾中间体A 进行的，这些中间体添加到具有卡宾特性的聚合物链末端。

1.3 自由基机理

基于光谱观测，多数人[32-35]认为共轭二乙炔的固相聚合机理属于自由基机理。Hori 等[32-33]在77 K 下对2，4-己二炔-l，6-二醇双-（对甲苯磺酸盐）〔2，4-hexadiyne-l，6-diol bis-（p-toluene sulfonate），TS〕单体晶体进行X 射线辐射时产生自由基（S=1/2）的ESR 光谱和结构进行观察后，认为中间体可能是上述的B 结构（自由基型）。在77 K 下用1 Mard 剂量的X 射线辐照5，7-十二碳二炔-1，12-二醇双（苯基氨基甲酸酯）单体单晶，观察产生的双自由基的ESR光谱和结构，并根据实验结果提出这种双自由基B是该单体晶体聚合的引发剂，该结果与在TS 中发现的结果相结合得出共轭二乙炔在低X 射线剂量下的固相聚合是自由基机理而非卡宾机理[33]。大部分人认为TS 在低转化阶段中的主要聚合方案是丁三烯路线，如图3 所示[35]。但是只有在ESR 结果中观察到自由基的行为与聚合行为严格平行时，才可以假定聚合反应是自由基机理[36]，同时也要考虑固态特有的因素，如晶格的影响、晶格缺陷的重要性、相变和分子迁移率[37]。

图3 共轭二乙炔固相聚合的可能方案[35]Fig.3 Possible schemes for solid-phase polymerization of conjugated diacetylenes[35]

从能量角度考虑，共轭二乙炔的固相聚合机理属于自由基机理。Chance 等[38]采用程序控制升温和等温差示扫描量热法技术评估了TS 晶体热聚合的量热研究，测得PTS 的Eα 值是与Wegner 的结果一致。同时他们提出讨论共轭二乙炔聚合机理，首要考虑引发事件（即二聚）是否基于分子轨道的“热允许”过程，而自由基方案恰好满足了这一点。因此，简单地从能量方面考虑，可认为二乙炔的固相聚合机理属于自由基机理[39]。Patel 等[40]根据2，4-己二炔-1，6-二（4-苯基偶氮苯磺酸钠）的活化能和聚合热与PTS 的对应值相同，提出双自由基二聚体作为此单体的链引发剂，并推测所有共轭二乙炔的固态聚合很可能是由双自由基二聚体引发的。另外，通过高级量子化学计算表明，取代的1，3-二乙炔在二聚反应方面比取代的乙炔更具反应性，且前者形成的双自由基通过自由基中心与相邻乙炔单元的共轭而稳定[41]。

另外，添加自由基引发剂也是用来证明共轭二乙炔的固相聚合机理属于自由基机理的一种手段。Hori和Kispert 在聚合过程中观测到自由基，认为可通过添加自由基引发剂来引发聚合。Patel 等[40]通过氯气引发了大多数的共轭二乙炔，并总结出大多数芳族取代的共轭二乙炔在上述气体存在下聚合，而不与主链发生主要反应；大多数脂肪族取代的共轭二乙炔首先部分聚合形成蓝色或红色物质，然后脱色。

然而，Enkelmann 等[42]认为共轭二乙炔的固相聚合有自由基机理或卡宾机理2 种，前者产生PBT，后者产生PDA。反应机理的阐明和反应中间体的鉴定一直是几个实验室争论和广泛研究的问题[43]。

2 共轭二乙炔单体的结构

2.1 基本结构要求

固相聚合是单体单晶向聚合物单晶的非分散转化，反应物晶格的排列是高度有序的，因此晶格分子的移动比较困难，只有分子的晶面具有合适的取向和分子间距离时才会产生反应中心。

Baughman 等[29]提出发生拓扑化学反应必须满足最小位移准则、基团理论标准、相变唯一性标准。同时，他还认为聚合过程中晶格结构变化通常最小[44]。共轭二乙炔及其衍生物的固相聚合反应是在拓扑化学控制下进行的，能发生聚合取决于单体晶体是否满足以下几个参数：两分子之间的距离d大约为5 Å、二炔棒和填充轴之间的夹角Φ大约为45°、RC1,C4＜4 Å；共轭分子棒必须旋转至少28°；相互反应的分子间的中心距必须减小约0.44 Å[29]。

2.2 取代基

除了要满足基本结构要求之外，共轭二乙炔单体要发生固相聚合也与取代基紧密相关。取代基有利于单体分子在其晶格内排列，共轭二乙炔的取代基中必须存在一个或几个将三键和取代基的官能团隔开的亚甲基，即内烷基链，以确保聚合过程中共轭二乙炔基团旋转的灵活性[31]。Ampornpun 等[45-46]对氨基甲酸乙酯取代的不同内烷基链长度的共轭二乙炔进行研究，热致变色结果表明，奇数个亚甲基有热致变色可逆性，而偶数个亚甲基没有。对于纯碳氢的共轭二乙炔，烷基链中碳数n为奇数的单体聚合速率比n为偶数的单体快得多（3＜n＜15），且它们均可光聚合。对双酰胺取代的不同外烷基链长度的共轭二乙炔来说，此规律亦符合上述规律，外烷基链n为奇数时聚合，而在n为偶数时不发生聚合，但在外界压力下可将其激活[47-49]。

取代基中含有氢键或高偶极矩的共轭二乙炔也易进行聚合[28,50]，其中取代基为磺酸酯、氨基甲酸酯、酰胺、羧酸基团或其盐的共轭二乙炔反应活性比较高，且含有大端基的单体通常比含有小端基的单体容易满足固态反应性和独特反应方向的标准，另外，取代基为环烷基类的共轭二乙炔的反应性明显高于无环类[51]。研究发现不同活性二取代共轭二乙炔的取代基与固态聚合物晶体质量的关系密切[35]。但是，根据共轭二乙炔取代基的化学组成预测其聚合行为仍然比较困难，一个原因是预测分子的晶格堆积比较困难，另一个原因是可能发生反应的构形空间非常小[36]。

2.3 改性和设计分子结构

不满足基本结构参数也无合适取代基的共轭二乙炔，可通过改性和设计分子结构使其发生聚合。从不同的溶液中改性共轭二乙炔，反应性有所不同，Khandelwal 等[52]对R-CH＝CH-C≡C-C≡C-CH＝CH-R 型共轭二乙炔在丙酮-石油醚、二恶烷-水、氯仿-石油醚和苯-氯仿中制备的化合物的晶体形状和固态反应性进行了总结，见表1。另外，在不同溶剂中重结晶2，4-己二炔-1，6-双乙基脲〔2，4-hexadiyn- 1，6-bis（ethylurea），KE〕单体，反应活性随溶剂不同而有显著不同[53]。

除了改性，使用其他策略也可以使原本不能满足分子堆积结构的共轭二乙炔发生聚合，一种是进行分子结构的合理设计[54]，特别是对侧基基团的调控，使分子间存在着一定的相互作用，如氢键[50]、协同组装、π-π 相互作用等，还有一种是超分子主客共晶策略[55-56]，最佳主体分子可以是脲或草酰胺，它们特有的氢键网络决定了分子间距接近4.9 Å，客体分子是共轭二乙炔单体，主体分子控制合适的分子间距离，客体提供反应功能，而且因为主客体之间连接的不是共价键，所以主体分子在聚合后很容易被除去，而得到纯净的聚共轭二乙炔。最近，Arun 等[57]将新型有机硒氰酸酯取代的共轭二乙炔 NC-Se-CH2-C≡C-C≡C-CH2-Se-CN 和双位路易斯碱1，2-双（2-吡啶基）乙烯（2-bpen）在(NC)-Se…NPy 硫属元素键（ChB）的作用下成功聚合，同时聚合伴随着ChB 受体分子（2-bpen）的升华，可得到纯聚共轭二乙炔且2-bpen 可定量回收。以往文献报道的可聚合的各类共轭二乙炔单体以及作用见表2[58-62]。

表2 文献中可聚合的各类共轭二乙炔单体以及作用Tab.2 Various types of polymerizable conjugated diacetylene monomers and their functions in the literature

3 共轭二乙炔固相聚合速率的影响因素

可聚合共轭二乙炔类指示剂化合物的有效反应性包括聚合反应速率的增加或减少、活化能的增加或减少、指示剂化合物的时间-温度响应曲线形状的变化，或2 个或多个前述参数的组合，例如反应速率的增加与活化能的增加和响应曲线修改的组合提供更尖锐的终点[59]。

3.1 外界环境

共轭二乙炔在热、光化辐射（如γ 射线、电子束、紫外线和x 射线）或外部压力[37,63-64]的作用下，反应速率会显著提高，往往温度越高、压力越大，其反应性越强。

3.2 共结晶

共结晶多种共轭二乙炔可以改变聚合反应速率[40]，且共结晶的方法有多种。共结晶组合物可以描述为固溶体，即分子水平上的紧密混合物，通过改变固态分子的堆积来改变共轭二乙炔的反应性，也影响了单体的活化能与聚合动力学。通常，如果选择两种或多种相似化学结构（分子结构和极性）的单体，则可获得更有效的晶体堆积。另外，共结晶组合物可以进一步区别于两种或多种单体的简单物理混合，通过差示扫描量热法可获得两者的温谱图，前者通常表现出一种新组分的焓变化、熔化行为、相变和转变温度等指标。共晶体聚合速率的变化程度取决于混合的特定共轭二乙炔单体的相对比例、单体的反应性、共结晶条件（如共结晶溶剂、溶解单体的温度、冷却速率）等因素[53]。

将PTS 与PFBS（R=-CH2OSO2C6H4F）共结晶时，PFBS 的含量越小时，聚合速率越快，且在PFBS 小掺量时（单体质量分数＜0.05），诱导期缩短，而在高掺量时，诱导期明显延长[42]。将带有芳基的共轭二乙炔单体共晶，可改变单个单体的反应速率，且少量含蒽的共晶体对聚合动力学有剧烈的影响，可使诱导期延长了一倍[65]。另外，质量比为1∶2 的KPr∶KE 在乙酸溶液中共结晶后得到的固溶体，热反应性最高[60,62]。

3.3 助剂

采用聚合引发剂、聚合促进剂等控制共轭二乙炔固相聚合速率是有效的。为消除紫外线的光诱导影响，将紫外线过滤器纳入共轭二乙炔类时间温度指示剂中[62]，其成分可以是二苯甲酮、苯并四唑、取代的丙烯酸酯和芳基酯。另外，常规引发剂也可提高共轭二乙炔类单体的热反应性，常用的有过氧化二枯基、过氧化苯甲酰、过氧化环己酮、过氧乙酸叔丁酯等。抑制剂可降低其聚合速率，常用的有苯醌、间硝基苯、2，4-二硝基氯苯等。

但理论上认为共轭二乙炔中加入固体或液体引发剂引发聚合是困难的，因为很难将它们掺入固体共轭二乙炔中，大分子自由基不太可能相对于棒状共轭二乙炔分子适当地定位以引发聚合，且很可能充当杂质阻止聚合[40]，因此，Patel 等[40]使用氯、溴、碘、亚硝酰氯、三氟化磷、氯化氰、臭氧和二氧化氮蒸气去引发共轭二乙炔聚合，发现它们都可以引发聚合。由于上述引发剂多为气体，多为剧毒且有腐蚀性，难以处理，因此用于实验研究而不用作商业用途。

聚合促进剂和聚合引发剂共同作用可较大改变共轭二乙炔的反应性，见表3[3]。根据上述Patel 等的说法，虽然助剂在共轭二乙炔的活性位点有空间不可达性，但使用此类组合物和方法的确可以使其的反应性得到有效增强。

表3 聚合引发剂和聚合促进剂对反应性的影响[3]Tab.3 Effects of Polymerization Initiators and Polymerization Accelerators on Reactivity[3]

3.4 金属或卤化氢

作为时间温度指示剂，大多数共轭二乙炔在合成后立即显示出反应性，所以需要在加工和运输过程中将其失活。专利US 4788151[60]首次公开了一种可易于控制的环境指示材料，将炔属化合物与有效的络合金属（指络合金属盐的阳离子）接触，通过改变炔烃部分的1，4-加成反应来控制炔烃化合物的活性，从而产生新的反应性（指增强、降低或完全悬浮现有的反应性）。另外加入卤化氢络合双脲共轭二乙炔，也能达到上述目的，卤化氢使炔属化合物的一种或多种脲官能团质子化，形成带正电荷的物质，然后与酸的阴离子缔合，重新定向脲侧链来控制原始炔属化合物的活性[61]。上述2 种方法均可使疫苗温度标签失活和再活化，以便加工和运输。

3.5 其他因素

江南大学钱静教授课题组[66]通过对KE、KPr 和KB 的进行了X 射线衍射以表征探究晶体产物的结晶度以及其变色速率快慢的机理，得出结晶度越高，分子链排列越规律，变色速率就越慢的规律。

4 研究现状及应用

70 年代以来，美国已公开了热致变色共轭二乙炔化合物可作为时间温度指示剂，并对部分热致、光致的共轭二乙炔单体的合成方法进行了描述。美国Temp-time公司成功研发出了HEATmarker®VVM[25]，原理是共轭二乙炔的在光、热作用下的固相聚合后的不可逆变色，是唯一一款获得WHO 产品认证的应用于疫苗热暴露量的标签，早已投入应用且技术成熟，各个国家的疫苗外包装均使用其作为VVM[67-68]。另外，未来美国还将VVM 与二维条码集成来构成单元级别的数字温度使用[69]。

我国共轭二乙炔类VVM 尚在初级研究阶段，2013 年，西北工业大学朱光明教授课题组[70-71]就已经发表过关于作为VVM 使用的单体如KE 和KPr的合成、显色动力学[72]、微胶囊的制备[73]及其聚合性研究，也研究了聚二乙炔囊泡的制备以及其在医疗检测领域的应用[74]。研究发现Hib 结合疫苗在25、37 ℃ 2 种恒温条件下，使用Temp-Time 公司的VVM 匹配性良好[75]。另外，2021 年，江南大学钱静教授课题组也开展了KE、KPr、KB 的合成以及KE 与KPr 的共聚速率的探究，研究了共聚单体的改性实验，且制备出了指示剂油墨并将其制成了标签[66-76]。同时，该课题组还对共轭二乙炔单体10，12-二十五碳二炔酸（PCDA）和10，12-二十三碳炔酸（TCDA）的刺激变色响应特性以及显色动力学进行了研究[77-78]。其次，我国在电子疫苗温度检测器[79]和染料升华类[80]的疫苗温度标签方面也有所成就，其中电子疫苗热敏感标签在“一带一路”环境中有良好的监测准确度及稳定性，且具有操作简单直观、可运输以及可数字化实时监测高低温异常的优势[79]。染料升华类 VVM 中，VVM7、VVM14 能够符合 WHO 产品标准，而VVM2 的终点响应时间略超出WHO 产品标准，需要对其终点响应时间进行调整[67-68,79]。重要的是，经检索，近20 年发表的时间温度指示剂和疫苗温度标签相关的英文文献总数高达两万多篇，而中文文献数量仅有几十篇，可侧面看出我国在时间温度指示剂方面的研究与国外差距仍然较大[81]，对共轭二乙炔类VVM 的关注度不够，参与此项研究的单位较少，研究进展缓慢。

目前，我国共轭二乙炔类VVM 面临的挑战是多方面的。首先，对共轭二乙炔的固相聚合机理及变色机理仍理解不足。其次，对共轭二乙炔单体的显色动力学未完全掌握，难以满足共轭二乙炔单体显色与疫苗效力变化一致的要求[82-83]；另外，大部分的疫苗保存温度在2～8 ℃，共轭二乙炔热致变色效应明显，但低于2 ℃时这类单体无法识别低温暴露，也无法显示温度波动的时间和位置；再次，能否克服 HEATmarker® VVM 需要在低温环境（-24 ℃）储存和粘贴这一缺点。近年来，随着我国经济高速发展，冷链物流需求激增，尤其是新冠病毒爆发以来，疫苗需求量激增，对疫苗的监测手段提出了更高的要求，疫苗温度标签市场前景广大[84-86]，这类VVM 可以有效解决我国疫苗冷链管理中冷链物流需求激增、冷链成本和区域发展不平衡等问题[87-90]。