房文文，王海凤，郭涛，姜艳芳，薛芳，张焕霞，陈峰，张士永

(山东省农业科学院湿地农业与生态研究所/山东省水稻工程技术研究中心，山东 济南 250100)

水稻为世界上一半以上的人口提供主粮[1]，稻瘟病是水稻生产上最重要的病害[2]。由稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)引发的稻瘟病在流行年份可使水稻减产40%～50%[3]。山东省自2013年以来，稻区多次发生稻瘟病，损失较大[4，5]。目前选育和利用抗瘟品种是防控稻瘟病最经济有效的措施[6]。由于田间稻瘟病菌小种类型多样且易变异，导致一些抗性品种连续种植3～5年后抗性“丧失”，田间表现为感病[7]。

目前已鉴定的水稻抗稻瘟病基因有100多个，其中有35个已被克隆[8]。主效抗瘟基因Pita位于水稻第12条染色体的近着丝粒区域，Jia等[9]开发的YL155/YL87和YL183/YL87可用于Pita基因的鉴定。抗、感水稻的Pita基因只有一个碱基差异，抗病基因为G，感病基因为T，其编码产物仅有一个氨基酸的差异，即第918位氨基酸由丙氨酸变异为丝氨酸[10]。Pizt基因位于水稻第6条染色体短臂端的Pi2/9基因簇内，含有等位基因Pi2、Pi9、Piz、Pigm、Pi40、Pi50，是广谱抗性基因；其中Pi2、Pi9、Pizt、Pigm已经被克隆[11－13]，根据Pi2与Pizt的编码产物在3个LRRs区域有8个氨基酸的差异[14]，开发出能够区分各基因的特异SNP标记[15]。Pik基因位于水稻第11条染色体长臂近末端区域，Pik座位上包括5个 等 位 基 因，分 别 为Pik、Pikh、Pikm、Pikp、Piks[16，17]。Pik1和Pik2两个基因的组合是表达Pik抗性所必需的，郭震华[18]、Luo[19]等开发了与Pik紧密连锁的分子标记Pik2－C/T。

目前，DNA分子标记检测是抗瘟基因鉴定的主要方法，包括SSR、InDel和SNP等分子标记，已经广泛应用于水稻育种研究。抗瘟基因的检测方法主要有特异分子标记的检测及已克隆基因测序分析[20]。高分辨率熔解曲线(high resolution melting，HRM)技术是一种新兴的基因分型方法，能够区分SNP、SSR及InDel等不同变异[21]，促进了抗性基因在水稻育种中的应用。此技术省略了凝胶电泳，减少了污染；PCR扩增后，无需其他步骤，仅需8～10 min即可读取96个样品数据，真正实现了快速高通量检测。HRM技术具有高通量、准确性高、重复性好等优点，已被广泛应用于分子标记辅助育种[22]。本研究基于HRM技术，利用3个已知稻瘟病抗性基因的特异分子标记对水稻品种是否携带抗性基因进行检测，以期为培育抗稻瘟品种及抗稻瘟品种布局奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水稻品种及优异种质资源共64份；感病对照品种为丽江新团黑谷(LTH)。

试剂及仪器:十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，购于生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR试剂，北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司；EvaGreen qPCR核酸染料，美国Biotium公司；其他试剂均为国产分析纯。Nikon D90相机，尼康光学仪器(中国)有限公司；BCD－290W型立式冰箱，青岛海尔股份有限公司；Eppendorf PCR仪，艾本德中国有限公司；罗氏LightCycler96实时荧光定量PCR仪，Roche公司。泥炭营养土，成分为挪威草炭、泥炭、珍珠岩及蛭石，寿光嘉恒基质加工厂；尿素，纯度≥46%，山东科达化肥有限公司。

1.2 序列分析

根据基因序列设计抗瘟基因引物，详细信息见表1，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 扩增Pita、Pizt和Pik2基因的引物序列

1.3 DNA提取、PCR扩增与HRM检测

水稻DNA提取:采用CTAB法提取水稻品种(系)的基因组DNA。

Pita、Pizt基因采用两步法进行PCR扩增。PCR反应体系(10 μL):2×EasyTaq®PCR Super-Mix 5 μL，基因组DNA 3 μL，正反向引物各0.2 μL(0.1 mmol/L)，20×Evagreen 0.125 μL，ddH2O 1.475 μL。PCR扩增程序:94℃预变性3 min；94℃变性10 s，57℃退火30 s，共40个循环。

Pik2基因采用多重巢式PCR扩增，包括两轮扩增反应。第一轮PCR反应体系(10 μL):2×EasyTaq®PCR SuperMix 5 μL，基因组DNA 3 μL，正反向引物各0.3 μL(0.1 mmol/L)，ddH2O 1.4 μL。PCR扩增程序:94℃预变性5 min；94℃变性20 s，57℃退火20 s，72℃延伸10 s，共40个循环；最后72℃延伸10 s。扩增产物加200 μL ddH2O后取0.5 μL、2×EasyTaq®PCR SuperMix 4 μL、正反向引物各0.3 μL(0.1 mmol/L)、20×Evagreen 0.125 μL、ddH2O 4.775 μL用于第二轮PCR扩增。PCR扩增程序:94℃预变性2 min；94℃变性20 s，59℃退火20 s，72℃延伸10 s，共25个循环；最后72℃延伸10 s。

3个基因扩增完成后，熔解曲线分析程序为:95℃变性15 s；60℃退火15 s；以0.07℃/s的速率升温，10次/℃采集荧光信号，至90℃保持1 s，采用软件Light Cycler 96进行熔解曲线分析。

2 结果与分析

2.1 Pita基因在供试水稻品种(系)中的分布情况

图1为Pita基因检测结果，蓝色曲线为感性基因pita，其碱基为T；红色曲线为抗性基因Pita，其碱基为G。20份水稻品种中含有纯合的抗性基因Pita，占供试品种的31.25 %；分别为15观57、矮丰80、20观83、19观6、润农11、金粳818、津原89、泗稻17、锦稻109、盐丰47、华粳113、扬粳3012－40、华粳9050、盐糯1716、天隆4号、扬农粳3142、香优108、盐粳252、缅甸稻、通化727。其余的44份为纯合的pita。

2.2 Pizt基因在供试水稻品种(系)中的分布情况

图2 为Pizt基因检测结果，红色曲线为抗性基因Pizt，蓝色曲线不含有Pizt基因(为pizt或其他等位基因)。14份水稻品种中含有纯合的抗性基因Pizt，占供试品种的21.88 %；分别为20Ta2－4、18T156、20观56、矮丰80、19观6、阳光900、临稻26、临稻29、润农11、苏秀867、宁香粳9号、华粳113、圣稻735、扬粳3012－40。其余的50份不含有Pizt基因(为pizt或其他等位基因)。

2.3 Pik2基因在供试水稻品种(系)中的分布情况

图3 为Pik2基因检测结果，蓝色曲线为感性基因Pik2，其碱基为T；红色曲线为抗性基因Pik2，其碱基为G。27份水稻品种中含有纯合的抗性基因Pik2，占供试品种的42.19%；分别为18RS15、20观56、20观83、19鉴21、临稻10号、临稻16号、润农11、润农303、金粳818、津原89、新丰2号、光灿1号、新科稻21、南粳9108、泗稻17、连粳13、宁香粳9号、圣稻735、华粳0098、华粳9050、盐糯138、扬农粳3142、香优108、缅甸稻、繁70、通化727、许日本稻。其余37份为纯合的pik2。可以发现，抗瘟基因Pik2在山东省分布较为广泛。

图3 Pik2基因的HRM分型

2.4 3个抗瘟基因在供试品种(系)中的分布

由表2可知，宁香粳9号、圣稻735、20观56共3份种质含有Pizt、Pik2两基因，占供试品种的4.69%；矮丰80、19观6、华粳113、扬粳3012－40共4份种质含有Pita、Pizt两基因，占供试品种的6.25%；20观83、金粳818、泗稻17、津原89、华粳9050、扬农粳3142、香优108、缅甸稻、通化727共9份种质含有Pita、Pik2两基因，占供试品种的14.06%；润农11同时含有Pita、Pizt、Pik2三个基因。

表2 3个抗瘟基因的基因型分布检测结果

3 讨论与结论

抗稻瘟病育种一直是研究的热点，目前分子标记辅助育种多采用常规PCR手段，需要通过凝胶电泳步骤，效率较低。本研究采用HRM技术鉴定了3个主效抗瘟基因在山东省水稻品种及种质资源中的分布情况，能够省略凝胶电泳等步骤，省时省力，高效准确，同时减少污染。本研究发现在64份材料中，含Pik2的品种有27个，占供试品种的42.19%；含Pita的品种有20个，占供试品种的31.25%；含Pizt的品种有14个，占供试品种的21.88%。含Pita和Pik2两基因的品种有9个，含Pita和Pizt两基因的品种有4个，含Pizt和Pik2两基因的品种有3个，同时含有三个基因的品种有1个。由此可见，抗瘟基因Pik2在山东省分布较为广泛。研究表明，不同地区水稻品种抗瘟基因频率存在差异，如郭震华等[18]发现抗瘟基因Pik2在黑龙江省分布也较为广泛，为32.9%，而杨林浩等[20]发现Pik在吉林省68个主栽品种中出现频率为13.2%。

本研究所检测的抗瘟基因偏少，下一步需基于已克隆的抗瘟序列信息及成功开发出的特异性分子标记，开发出更多抗瘟基因的SNP标记，进行多个基因检测及抗瘟育种辅助选择。另外，本研究仅采用分子标记检测方法鉴定了抗瘟基因，下一步拟结合室内人工接种方法，将抗瘟基因组合与抗病性评价进行对应，对于指导培育抗病品种具有重要意义。