郭燕，孙岚萍，顾志荣，杨浩，葛斌（.甘肃中医药大学药学院，兰州 730000；2.甘肃省人民医院药剂科，兰州 730000）

扶正救肺颗粒是甘肃省人民医院的临床经验方，益气、健脾、活血是其基本治法，由黄芪、炒白术、生地、当归等14 味药物组成。方中黄芪[1]、白术[2]补正气之虚为君药；北沙参[3]、麦冬、地黄养阴清肺为臣药；丹参[4]、川芎[5]、当归[6]等活血化瘀为佐药；甘草补脾益气为使药。具有清热活血、益气的功效，治疗特发性肺间质纤维化疗效显著[7]，目前已在临床应用十余年。扶正救肺颗粒由14 味中药提取而成，其有效成分复杂多样，仅对单一成分进行定量分析，难以全面、真实地评价其整体质量。王智民等[8]率先提出一测多评法（QAMS），利用中药及复方制剂中的一种成分的对照品作为内参物，建立该成分与其他成分之间的相对校正因子，通过相对校正因子计算其他成分含量，来实现多个成分的同步测定，具有快速、简便、成本低等优点，近年来在中药复方制剂质量评价中得以推广应用[9-11]。本研究在建立HPLC 指纹图谱的基础上，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参照物，应用QAMS 测定扶正救肺颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素4 种成分的含量，为全面、准确地控制和评价扶正救肺颗粒的质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器

十万分之一Sartorius BT 125D 型精密电子天平（德国Sartorius 公司）；HH-4 型数显水浴锅（西安超杰仪器有限公司）；SB25-12DTD 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；岛津LC-16 型高效液相色谱仪（岛津仪器有限公司）；YC-1000 实验室喷雾制粒包衣机（上海雅程仪器设备有限公司）。

1.2 试药

黄芪、炒白术、北沙参、地黄、麦冬、丹参、川芎、当归、陈皮、桔梗、瓜蒌、紫菀、款冬花、甘草14 味中药饮片（甘肃陇脉药材有限公司，经甘肃省人民医院郑秀丽副主任中药师鉴定）；橙皮苷（批号：110721-201316）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号：CHB171102）、毛蕊花糖苷（批号：CHB171103）、芒柄花素（批号：CHB171026）对照品（纯度≥98%，成都克洛玛生物科技有限公司）；乙腈、甲酸为色谱纯（天津大茂有限公司）；其余试剂均为分析纯；扶正救肺颗粒（甘肃省人民医院制剂室制备，编号：S1～S15，规格：15 g/袋）。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件 反相WondaSil C18-WR 色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，8%～13%A；10～20 min，13%～20%A；20～40 min，20%～40%A；40～50 min，40%～55%A）；检测波长300 nm；流速1.0 mL·min－1；柱温40 ℃；进样量10 μL。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素对照品适量，置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得质量浓度为0.9520、0.1596、2.5080、0.0532 mg·mL－1混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取10 g 样品，置包有遮光纸的具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声60 min，3000 r·min－1离心10 min，取上清液，溶剂回收至干，以甲醇定容至5 mL 量瓶中，0.45 μm 微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。按最佳工艺[12]制得缺地黄、黄芪、陈皮的阴性样品溶液，进样测定，色谱图见图1。

图1 混合对照品（A）、样品（B）、缺地黄阴性样品（C）、缺黄芪阴性样品（D）、缺陈皮阴性样品（E）HPLC 色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of mixed reference（A），sample（B），negative sample without Rehmanniae Radix（C），negative sample without Astragali Radix（D），and negative sample without Citri Reticulatae Pericarpium（E）

2.1.4 线性关系考察 取混合对照品溶液，用甲醇分别稀释系列成系列对照品溶液，进样测定，以质量浓度X（mg·mL－1）为横坐标、峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1。

表1 各成分线性关系Tab 1 Linearity of various constituents

2.1.5 精密度试验 取混合对照品溶液，连续进样6 次，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷和芒柄花素的峰面积RSD分别为0.37%、0.75%、0.53%、0.44%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取供试品溶液6 份，进样测定，结果样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷和芒柄花素含量RSD分别为0.32%、0.85%、0.37%、1.0%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取S1 号供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 进样测定，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷和芒柄花素的峰面积RSD分别为3.0%、2.6%、2.0%、1.6%，表明样品在24 h 内稳定性良好。

2.1.8 加样回收试验 称取已知含量的扶正救肺颗粒6 份，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别加入一定量的对照品溶液（1∶0.5、1∶1、1∶1.5），按“2.1.3”项下方法制备，进样测定，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷和芒柄花素的平均回收率分别为100.11%、100.45%、99.38%、100.28%，RSD分别为1.4%、2.0%、0.79%、2.1%。

2.2 指纹图谱

2.2.1 指纹图谱共有模式的建立 取15 批扶正救肺颗粒（S1～S15）样品，按“2.1.3”项下方法制备，进样测定，记录色谱图，通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012年版进行分析，通过检测得到的共有峰与混合对照品保留时间对比指认了4 个成分，分别是13 号峰毛蕊异黄酮葡萄糖苷、14 号峰毛蕊花糖苷、17 号峰橙皮苷、24 号峰芒柄花素，保留时间分别为22.578、23.786、26.484、44.683 min。结果见图2。

图2 混合对照品（A）和代表性样品（B）HPLC 色谱图Fig 2 HPLC of mixed reference substance（A）and representative sample（B）

2.2.2 14 味处方药材溶液的制备 分别称取黄芪、炒白术、北沙参、地黄、麦冬、丹参、川芎、当归、陈皮、桔梗、瓜蒌、紫菀、款冬花、甘草适量，粉碎，按“2.1.3”项下方法制备每味药材的供试品溶液。

2.2.3 指纹图谱的相似度评价与聚类分析 以S1扶正救肺颗粒指纹图谱作为参照图谱，绘制15 批颗粒的指纹图谱，见图3。指纹图谱共确定24 个共有峰，将13 号峰作为指纹图谱为参照峰；通过保留时间及紫外光谱确定了其中5 个峰所对应的成分，分别是阿魏酸（12 号峰）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（13 号峰）、毛蕊花糖苷（14 号峰）、橙皮苷（17 号峰）及芒柄花素（24 号峰）。计算15 批扶正救肺颗粒指纹图谱的相似度，结果见表2。15批供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均＞0.92，表明制备工艺所得的颗粒质量稳定、均一。

表2 15 批扶正救肺颗粒指纹图谱的相似度Tab 2 Similarity of fingerprints of 15 batches of Fuzheng Jiufei granules

图3 15 批扶正救肺颗粒HPLC 指纹图谱Fig 3 HPLC fingerprints of 15 batches of Fuzheng Jiufei granules

将15 批扶正救肺颗粒的共有峰峰面积进行数据标准化，进行系统聚类分析，聚类方法为“最短距离法”，结果见图4。当距离为10 时，除S1、S2 外，其余13 批样品被分为一类，进一步说明不同批次颗粒质量稳定、均一。聚类结果与相似度分析结果基本一致，S1、S2 相似度较小。

图4 15 批扶正救肺颗粒聚类树状分析图Fig 4 Cluster dendrogram of 15 batches of Fuzheng Jiufei granules

2.2.4 共有峰的归属 取14 味药材的供试品溶液，分别按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，通过各单味药的色谱峰保留时间及紫外光谱，分析各色谱峰的药材来源，结果见图5及表3。

表3 共有峰的来源Tab 3 Sources of common peak

图5 扶正救肺颗粒HPLC 指纹图谱共有峰药材归属Fig 5 Common peak attribution in fingerprints of Fuzheng Jiufei granules

2.3 一测多评法

2.3.1 相对校正因子 以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为内标，按公式计算其他3 种成分的相对校正因子，（fs/k）＝fk/fs＝（CsAk）/（CkAs）（Cs为内参物质量浓度，As为内参物峰面积，Ck为待测成分质量浓度，Ak为待测成分峰面积），结果见表4。

2.3.2 样品测定 取5 批扶正救肺颗粒制备供试品溶液进样检测，采用外标法（ESM）同时测定4 种成分的含量，用QAMS 法建立各待测物的相对校正因子测定3 种待测成分量，比较2 种方法测定结果的差异。结果2 种方法所测得各成分的含量基本一致，相对平均偏差（RAD）＜2.0%，结果见表5。表明QAMS 可用于扶正救肺颗粒中4 个化学成分的含量测定。

表5 QAMS 法与EMS 法测定扶正救肺颗粒各成分的含量Tab 5 Content of components in Fuzheng Jiufei granules by QAMS method and ESM method

3 讨论

黄芪作为该方君药，内能补脾肺之气，外可固表止汗，主要化学成分为多糖、黄酮、皂苷等，黄芪中的总黄酮有抑制肺纤维化上皮-间质转化（EMT）作用[13]。橙皮苷为陈皮主要活性成分，现代药理研究发现橙皮苷具有抗炎、抗菌、调节免疫等药理活性[14-15]，可抑制肺成纤维细胞活化[16]。同时，张慧等[17]发现毛蕊花糖苷对于内毒素诱导的小鼠急性肺损伤有保护作用。因此，选取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、芒柄花素和橙皮苷4 种成分作为扶正救肺颗粒质量控制的指标成分。

检测了不同波长下（220、280、300 nm）的指纹图谱，结果发现检测波长为300 nm 时，基线平稳，各峰形较好，标定出24 个共有峰，能较多地反映出扶正救肺颗粒的内在质量信息。

QAMS 法和外标法测得毛蕊花糖苷、芒柄花素和橙皮苷含量的偏差均不高于2.0%，测定结果无明显差异，表明QAMS 法准确且可靠。在含量测定的基础上，建立指纹图谱，15 批样品指纹图谱相似度均在0.92 以上，表明不同批次样品的化学成分具有较好的一致性。

指纹图谱技术具有模糊性、整体性和专属性，能全面反映扶正救肺颗粒的内在化学特征[18]；同时，选取4 种活性成分进行QAMS 法多指标定量，可在缺少对照品的条件下以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为内标，准确定量其他组分，降低了分析检测成本。本研究将指纹图谱和QAMS 法相结合，既考察了样品中多个指标性成分的含量，又考察了其指纹图谱整体相似度，建立的分析方法简便、准确、重复性好[19]，为扶正救肺颗粒质量控制与评价提供了一定的参考。