王桂华，王妮拉，阳帆帆，宋颖辉，柴琴*（.南华大学附属长沙中心医院，长沙 40004；.福州肺科医院，福州 50008；.湖南省人民医院，长沙 40000）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma） 主要见于北非、中东和亚洲，尤其是我国的华南地区[1]。在临床上，大多数鼻咽癌都是低分化鳞状细胞癌或未分化癌[2]。鼻咽癌易发生转移，且鼻咽部结构复杂难以手术，因此化学治疗和放射治疗已成为鼻咽癌治疗的主要方法，且放射治疗是首选[3]。近年来随着免疫治疗的出现和发展，其逐渐成为复发和转移性鼻咽癌的一种可选治疗手段。此外，放射治疗已经被证实能通过DNA 损伤和旁路效应激活免疫系统，从而提高免疫治疗疗效[4-5]。放射治疗可以单独应用、联合化疗、联合靶向治疗以及联合免疫治疗等手段抗肿瘤，表明放射治疗在鼻咽癌的治疗中起着至关重要的作用。虽然放射治疗技术在最近几年得到了极大的改善，特别是调强放射治疗（intensity-modulated radiation therapy，IMRT）技术的应用[6]，但仍然存在一定的瓶颈，肿瘤细胞的辐射抗性是造成鼻咽癌局部复发或转移的主要原因[7]。因此，迫切需要探索提高放射治疗敏感性的新药物，从而提高患者的生存期。

引起鼻咽癌辐射抗性的机制非常复杂，其中最主要的是信号转导子和转录激活子3（signal transducers and activators of transcription 3，Stat3）的异常激活。已证实Stat3 信号通路的持续激活涉及肿瘤促进活动中的细胞增殖、转移、血管生成、宿主免疫逃避和对细胞凋亡的抵抗[8-9]。Stat3被持续激活并在鼻咽癌细胞的细胞核中表达[10]。最近，有报道称Stat3 抑制剂Stattic 增强了鼻咽癌的辐射敏感性[11]。Stat3 抑制剂似乎是鼻咽癌细胞辐射敏感性的一种重要靶向抑制剂。

吴茱萸碱（evodiamine，EVO）是从芸香科植物吴茱萸中提取出的活性生物碱，具有多重药理作用，包括抗炎、降压、镇痛、抗过敏等[12]。同时，EVO 具有抗前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤和结肠癌等活性[13]。然而，EVO 在鼻咽癌中对辐射敏感性的影响和潜在机制仍不清楚。本研究以鼻咽癌细胞5-8F 和6-10B 为对象，探讨EVO 对鼻咽癌细胞的辐射敏感性影响及其作用机制，从而为鼻咽癌放射治疗提供新的增敏药物。

1 材料与方法

1.1 细胞系

鼻咽癌细胞系5-8F 和6-10B 从湘雅医学院细胞库获得[14]。鼻咽癌细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的培养基中生长。所有培养基均添加100 U·mL－1青霉素/链霉素，细胞在37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.2 试药

EVO（上海爱必信生物科技有限公司），CCK-8 试剂盒（日本熊本同仁化学研究所），AnnexinV/FITC 检测试剂盒（北京佳美生物科技有限公司）。

1.3 细胞照射

细胞按分组在6 MV X 线（Varian Accelerator 600 C）室温下在0～8 Gy 内分别照射，受照射的细胞与其他实验组平行运输，剂量率：250 MU·min－1，照射射野：15 cm×15 cm，源皮距：100 cm。所有平板在再次照射时均涂上一层补偿胶。

1.4 CCK-8 检测细胞增殖

将指数生长期收集的鼻咽癌细胞接种在96孔板中，每孔密度为5000 个细胞，分为对照组（0.1%DMSO）或EVO 组（不同浓度），每组设置5 个孔。EVO 组用EVO 处理细胞24 h、48 h 或72 h 每孔加入10 μL CCK-8 试剂，并将细胞继续培养3 h，用酶标仪在450 nm 处测量吸光度（A）值，每组实验重复3 次。

1.5 克隆集落形成实验检测细胞存活率

将细胞重新计数、接种到6 孔板上，密度为每孔500 个细胞，加2 mL 培养基培养，待培养24 h 后进行分组，实验分为对照组、EVO 组（5 μmol·L－1）、照射组（2、4、6、8 Gy）以及EVO 联合照射组。培养48 h 后弃去培养基，加入不含药物的新鲜培养基，细胞继续培养12 d 后，用甲醇固定细胞、Giemsa 染色，计算细胞数超过50 个的集落视为克隆存活。每组实验重复3 次。

1.6 流式细胞术检测细胞周期和凋亡

对照组、EVO 组（5 μmol·L－1）、照射组（6 Gy）及EVO 联合照射组培养24 h 后，收集并固定在70%乙醇中，4 ℃保存24 h。移去固定液后，细胞用含5 μmol·L－1PI 和50 μmol·L－1RNase 溶液（Sigma Aldrich 试剂）染色，在室温条件下避光固定30 min。然后使用FACSuite 分析软件（BD 生物科学）对细胞周期分布进行精确分析，对细胞周期不同阶段的细胞百分比进行统计和比较。每组实验重复3 次。细胞分组及处理方法同前，然后用0.25%胰蛋白酶消化、收集，冰PBS 洗涤2 次，用300 μL Binding Buffer 重悬，加入5 μL Annexin-V 和5 μL PI 避光染色15 min，在上机分析前加入200 μL Binding Buffer 重悬，使用FACSuite 分析软件对细胞凋亡情况进行分析，每组实验重复3 次。

1.7 流式细胞术检测活性氧

使用活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒检测细胞ROS 水平，使用FACSuite分析软件分析ROS 水平，每组实验重复3 次。

1.8 Western blot 法检测蛋白表达程度

首先加入细胞裂解液提取所有细胞蛋白，然后使用Micro BCA 蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度，将总蛋白质（20 μg）上样到每个样孔中。使用以下抗体和稀释液用作上样对照：抗stat3 抗体（1∶1000）、抗磷酸化stat3 抗体（1∶1000），抗GAPDH 抗体（1∶2000）。

1.9 统计学分析

每组数据均经过3 次独立重复实验后得出，实验结果用均数±标准差表示，用统计学软件SPSS 进行数据分析。采用单因素方差分析对各组之间的差异进行统计显著性检验，P≤0.05 认为差异有统计学意义。图表使用GraphPad Prism 5 软件生成，放射生物学参数用Sigmaplot 10.0 软件线性二次方程计算模型，辐疗增敏比（SER）D0/Dq由照射的细胞与EVO 联合照射的细胞计算得出。

2 结果

2.1 EVO 对鼻咽癌细胞的抑制作用

用不同浓度的EVO（0～20 μmol·L－1）处理5-8F 和6-10B 细胞，分别培养24、48 和72 h，用CCK-8 测定细胞活力，结果见图1。结果表明，该药物对5-8F 和6-10B 细胞的增殖具有显著的抑制作用，且呈时间依赖性。根据细胞增殖抑制实验，EVO 浓度为5 μmol·L－1、培养48 h 的细胞更接近IC20值，选择该浓度进行后续实验，以验证EVO对鼻咽癌细胞辐射敏感性的影响和机制。5-8F 细胞24、48、72 h 的IC50值分别为（49.648±8.394）、（9.378±2.569）、（5.297±1.476）μmol·L－1；6-10B细胞24、48、72 h 的IC50值分别为（73.667±10.285）、（15.289±3.648）、（7.676±2.574）μmol·L－1。

图1 不同浓度EVO 对鼻咽癌细胞的抑制率Fig 1 Inhibitory rate of different concentrations of EVO on NPC cells

2.2 EVO 对鼻咽癌细胞辐射敏感性的影响

与对照组相比，5-8F 细胞照射组的存活率有所下降（见图2A）。此外，在该细胞系中，EVO 联合照射组较照射组细胞存活率显著下降（P＜0.05）。在6-10B 细胞系也显示出同样的下降趋势（见图2B）。这些结果表明，EVO 可以增强对照射引起的细胞克隆形成的抑制作用，导致5-8F 和6-10B 细胞的辐射敏感性增加。5 μmol·L－1EVO 在5-8F 和6-10B 细胞上的D0计算的SER 分别为1.24 和1.35，5 μmol·L－1EVO在5-8F 和6-10B 细胞上的Dq计算的SER 分别为2.26 和1.60。

图2 不同照射剂量对鼻咽癌细胞存活率的影响Fig 2 Effect of different irradiation doses on the survival rate of NPC cells

2.3 EVO 对鼻咽癌细胞周期分布的影响

一般认为细胞周期分布会影响细胞的辐射敏感性，而G2/M 期是对照射最敏感的细胞周期[15]。PI染色结果表明，与照射组相比，EVO 可诱导鼻咽癌细胞抑制在G2/M 期、EVO 联合照射可能会将更多鼻咽癌细胞阻滞在G2/M 期（P＜0.05）（见图3）。

图3 EVO 对鼻咽癌细胞周期分布的影响（*P＜0.05）Fig 3 Effect of EVO on the distribution of NPC cell cycle（*P＜0.05）

2.4 EVO 对鼻咽癌细胞凋亡的影响

细胞凋亡是照射后引起细胞死亡的主要形式，暴露于照射后的细胞凋亡是评估辐射敏感性的重要指标[16]。PI/FITC-Annexin V 染色对细胞凋亡的分析表明，与EVO 组及照射组相比，EVO 可诱导鼻咽癌细胞凋亡，而EVO 联合照射可诱导更多细胞凋亡（P＜0.05）（见图4）。

图4 EVO 对鼻咽癌细胞凋亡的影响（*P＜0.05）Fig 4 Effect of EVO on apoptosis of NPC cells（*P＜0.05）

2.5 EVO 对鼻咽癌细胞ROS 水平的影响

照射通过诱导ROS 激活内源性细胞凋亡级联反应导致细胞凋亡[16]，ROS 的量可以部分反映照射引起的细胞死亡程度。ROS 水平检测显示EVO 可以增加ROS 的产生，EVO 联合照射较EVO 组或照射组增加更多的ROS 产生（P＜0.05）（见图5）。这些结果表明EVO 和照射对ROS 的产生具有协同作用。

图5 EVO 增强X 线照射诱导鼻咽癌细胞ROS 的表达水平（*P＜0.05）Fig 5 EVO enhances the expression level of ROS in NPC cells induced by X-ray irradiation（*P＜0.05）

2.6 EVO 对X 线照射后Stast3 的活化程度的影响

采用Western blot 分析EVO 联合照射后鼻咽癌细胞信号通路分子的变化。结果发现Stat3 在24 h 后被单剂量6 Gy 照射激活。EVO 可以下调5-8F 细胞和6-10B 细胞中的磷酸化-Stat3 的表达。此外，EVO 可以降低鼻咽癌细胞中X 线照射后Stat3 的活化程度（见图6）。

图6 X 线照射后鼻咽癌细胞Stast3 的活化程度（*P＜0.05）Fig 6 Activation of Stat3 in NPC cells after X-ray irradiation（*P＜0.05）

3 讨论

辐射抗性是晚期鼻咽癌预后不良的主要原因[2]，辐射增敏剂已被广泛探索以证明其在临床鼻咽癌中的应用价值。在本研究中，EVO 可抑制5-8F 和6-10B 细胞增殖，诱导细胞周期阻滞在G2/M 期，EVO 增强了鼻咽癌细胞的辐射敏感性。

评估细胞存活最可靠方法之一是克隆集落形成实验，这是检测辐射敏感性的金标准[17]。本研究显示，EVO 联合照射组较照射组的细胞存活分数显著降低，因此，EVO 可能会对鼻咽癌细胞具有辐射增敏作用。多项研究表明EVO 可以增强各种肿瘤细胞的辐射敏感性[18-19]。EVO 通过下调Her-2/AKT/Bcl-2 信号增强食管鳞状细胞癌Eca-109 细胞和胃癌BGC-823 细胞的辐射敏感性[20]，这表明EVO 的放射增敏作用可能在许多类型的癌症中普遍存在，其在包括鼻咽癌在内的癌症中的机制值得广泛研究。肿瘤辐射敏感性与许多因素有关，包括肿瘤微环境、细胞凋亡、细胞周期调控和DNA 修复功能障碍[21]。细胞凋亡是照射后细胞死亡的重要机制，并且凋亡与肿瘤辐射敏感性成显著正相关[16]。本研究中，EVO 联合照射组细胞的凋亡率较单纯照射组显著增加，说明其对鼻咽癌细胞具有潜在的放射增敏作用，具体相关机制有待进一步研究。G2/M 期细胞对放射最敏感，而S 期细胞则具有放射抗性[15]。本研究表明，小剂量单独照射可以诱导鼻咽癌细胞进入G2/M 期，且EVO 联合照射可诱导更多鼻咽癌细胞阻滞于G2/M 期，这可能是另一个潜在放射增敏作用机制。此外，ROS 也是公认的辐射敏感性指标。一般认为，照射诱导的ROS 的产生与照射后细胞的损伤直接相关[22]。关于EVO 与ROS 的关系的研究较多，但EVO 是增加还是减少ROS，目前还没有一致的结论[23-24]。在本研究中，与对照组相比，单独应用EVO 可以显著增加ROS 的产生，与照射组或EVO 组相比，EVO 预处理后照射组使鼻咽癌细胞ROS 的产生显著增加。

值得注意的是，照射后会触发一系列促生存信号通路，从而导致细胞辐射抗性。以往的研究已明确了照射可以激活肺癌细胞中的NF-κB 和P38/MAPK 信号通路[25]。此外，我们在鼻咽癌细胞中发现了类似的现象，即P-Stat3 在照射后表达上调。有大量研究表明EVO 可以减少Stat3 的激活[26-27]，因此，本研究探讨了EVO 联合照射治疗是否可以减少照射对信号通路的激活，发现单独应用EVO 可以显着降低P-Stat3 的表达，联合照射可以抵消照射对Stat3 的激活，这与其他研究一致。推测EVO 可能通过减少照射后促生存信号通路的激活来发挥放射增敏作用。

总之，EVO 可抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导细胞周期阻滞于G2/M 期，且EVO 增强了鼻咽癌细胞的辐射敏感性。基于本研究的发现，EVO 有望开发成为放射增敏剂的重要药物之一。但本研究仍存在不足之处，具体EVO 的放射增敏机制还有待进一步探讨，包括其相关分子机制及信号传导通路等。