秦该照，唐明华，赖亚琳，袁黎明

（云南师范大学化学化工学院,昆明 650500）

构成生命体的DNA、氨基酸、糖和蛋白质等均具有手性，手性在自然界中无处不在［1，2］.长期以来，药学一直都是手性分离的热点［3］；手性药物的每一种对映体通常会表现出显著不同的药理、代谢、治疗或毒理学作用，对于许多外消旋药物来说，只有一种对映体具有所需的生物活性，而另一种对映体可能显示出不同的作用，甚至表现出副作用［4，5］.因此，对映体的分离具有重要研究价值，而色谱技术是一种分离对映体的有效方法.在过去的几十年里，色谱技术［如高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）和毛细管电泳（CE）］被广泛应用于对映体分离中［6～9］.CE（如毛细管区电泳、胶束电动色谱和毛细管电色谱）由于其灵敏度较高、分离效率高及成本低的分离优点等［10～18］，成为传统色谱技术的有力替代方法.然而，由于所形成配合物的稳定常数不同，使得毛细管电泳过程中产生了不同电渗流，最终导致电泳迁移率也不同.

CE是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法，其原理就是分析物在电场中通过产生不同的电渗流从而产生不同的迁移速度进行的分离.如今，随着高效液相色谱分离手性药物的兴起，CE也被作为一种色谱分离技术用于手性药物拆分.CE的分离效率与固定相的选择性相结合，在最佳条件下，分析物沿着填充在由电场驱动的毛细管中的手性固定相迁移.即，由于CE能改进峰形且电解质消耗量低，以及手性固定相选用范围广等优点，使其在手性化合物的分离分析中具有广阔前景［19，20］.

金属有机笼（MOCs）由多个氧化还原活性金属阳离子中心与配位连接的光活性配体构成，因其特有的形状和空腔及适当的纳米尺寸等特点而得到开发应用［20，21］，为发展色谱分离技术的手性固定相奠定了基础.作为一种离散类超分子复合物，它们通常极易溶于有机溶剂中，并且在分子识别、分离、离子交换、气体吸附、有机和光催化及药物传递等领域具有重要的应用价值［22，23］.近年来，手性MOCs研究已成为超分子化学和材料科学中最有吸引力的课题之一［24］.但是，手性MOCs作为固定相应用于毛细管电泳中的研究鲜见报道.

本文制备了一种手性MOC［Cu12（LPA）12（H2O）12］，每个手性MOC-PA笼分子由12个配体分子和12个水分子构成，笼分子中包含204个烷基，由它们装饰着球形笼的整个外表面.每个MOC-PA手性笼分子内含6个双金属桨轮Cu-Cu结构，且每个Cu—Cu键的两端各连有1个水分子，1个指向多面体的内部腔，另1个与其呈180°指向相反方向.在手性MOC-PA作为一种新型的立体选择性固定相应用于毛细管电泳之前，该材料已经被应用于气相色谱中且对手性药物有较好的拆分效果，并且在大多数有机溶剂中都有较好的悬浮性.本实验采用动态涂覆法，将［Cu12（LPA）12（H2O）12］悬浮在无水乙醇中，然后进行超声，将悬浮液涂覆在已粗糙化过的石英毛细管中，通过毛细管电泳技术进行分离.研究结果表明，该材料对手性药物具有良好的拆分效果.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

1，4，5 ，8-萘四羧二酐、乙酸、三水合硝酸铜和硫脲，分析纯，上海化工厂；L-苯丙氨酸，分析纯，山东化工厂；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和异丙醇（IPA），分析纯，天津化工厂；1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻，分析纯，比利时Acros Organics化工厂；硝基苯酚，分析纯，上海Aladdin化工厂；生物缓冲剂三羟基氨基甲烷（Tris），分析纯，北京化工厂.

所有手性药物的分离均在CL 1020+CL 101型高效毛细管电泳仪（CE）上进行，配备的紫外检测器检测波长为190～700 nm，北京华阳利民仪器有限公司；D8 Advance型X粉末衍射仪（PXRD），德国Bruker公司；Spectrum100型傅里叶变换红外光谱仪（FIIR），美国PerkinElmer公司；AV ANCEⅢHD400型核磁共振波谱仪（NMR），德国Bruker公司；Noav NanoSEM450型扫描电子显微镜（SEM），美国FEI公司；SDT650型热重分析仪（TGA），上海云谱仪器有限公司.

1.2 实验过程

1.2.1 配体H2LPA的合成参照文献［25］方法合成配体H2LPA，步骤如Scheme 1所示，将3.0 g（11.2 mmol）1，4，5，8-萘四羧二酐和4.797 g（23.5 mmol）L-苯丙氨酸充分溶解在80 mL乙酸中，所得混合溶液在120℃下回流36 h，反应结束后，加入200 mL超纯水，得到棕色沉淀，过滤，用一定量的超纯水洗涤滤饼，于80℃下真空干燥，得到淡黄色固体H2LPA.

Scheme 1 Synthesis step of ligand H2LPA

1.2.2 手性金属有机笼MOC-PA的合成如Scheme 2所示，采取一锅合成法，将28.1 mg配体H2LPA（0.05 mmol）和12.1 mg三水合硝酸铜分别溶于2 mL DMF和1 mL IPA中，再将它们混合在高压反应釜中，密闭条件下加热至90℃，反应48 h，然后冷却至室温，依次用乙醇和高纯水洗涤3次，于85℃真空干燥箱中干燥，得到绿色MOC-PA晶体.

Scheme 2 Synthesis step of chiral MOC-PA

1.2.3 手性金属有机笼MOC-PA毛细管色谱柱的制备石英毛细管柱的粗糙化处理：首先用1 mol/L氢氧化钠冲洗石英毛血管柱1.5 h，再用高纯水冲洗至中性，而后用1 mol/L的盐酸冲洗1.5 h，再用高纯水冲至中性，最后用氮气将毛细管柱于120℃下吹干，备用.

称取一定量研磨后的MOC-PA固体悬浮在无水乙醇中，浓度为3 mg/mL，超声10～20 min.将悬浮液用氮气缓慢地吹入粗糙化后的毛细管柱中，待充满整个毛细管柱后，再将氮气的气流调小，持续吹3 h，直至溶液吹干并继续对其进行老化，以2℃/min的升温速度在GC中程序升温至120℃，保持120 min.

1.2.4 毛细管色谱柱的实验条件采用Tris-H3PO4缓冲体系，电渗流标记物为硫脲.截取一段手性MOC-PA开管毛细管色谱柱（60 cm×75 μm），在距末端10 cm处开窗，色谱柱的有效分离长度为50 cm.初次使用该色谱柱前，用高纯水、缓冲溶液依次冲洗毛细管色谱柱直至基线稳定.实验过程中，样品的紫外检测波长均为254 nm，进样时间为5～6 s.

2 结果与讨论

2.1 手性MOC-PA晶体的表征

2.1.1 X射线粉末衍射和红外光谱采用X射线粉末衍射仪对手性MOC-PA进行了表征，探究其内部结构，结果如图1所示.其在2θ=5°～10°处的特征衍射峰与文献［25］报道基本一致，表明已合成手性MOC-PA.

为了进一步证明已合成手性MOC-PA，对其进行了红外光谱表征，选用KBr压片法分别对H2LPA和手性MOC-PA进行测试.如图2所示，配体H2LPA在766和691 cm-1处的强峰表明有苯上的C—H键的弯曲振动；1582和1445 cm-1处的强峰与苯的骨架振动相对应；1716和1662 cm-1处的峰分别是由叔酰胺和羧酸的C=O键伸缩振动引起.在手性MOC-PA的谱图中，H2LPA配体中C=O键对应的峰分别移至1654，1407和1335 cm-1，这可能是由于形成的双金属桨轮Cu—Cu键与水分子的相互作用.该结果与文献［26］报道基本一致.

Fig.1 XRD patterns of chiral MOC-PA crystal powder(a)and the reported one(b)

Fig.2 IR spectra of H2LPA(a)and chiral MOC-PA(b)

2.1.2 热重分析进行毛细管电泳测试时，毛细管色谱柱内部两端会有高达几千伏甚至几万伏的电压，电流通过管壁时会与缓冲溶液产生大量的焦耳热.因此，毛细管电泳的手性固定相必须要有一定的热稳定性.为了考察手性MOC-PA的热稳定性，对其进行了热重分析.以10℃/min的速率将MOC-PA材料从25℃升温到800℃，从其热重曲线图（图3）可以看出，手性材料MOC-PA在350℃以前具有一定的热稳定性，从约350℃开始失重，并在450℃时达到最大分解，因此在色谱柱中产生的焦耳热对其没有太大的影响.

Fig.4 SEM image of chiral MOC-PA

2.1.3 SEM表征 图4为MOC-PA的SEM照片，可见该材料由片状四边形结构堆叠而成，纳米片厚度约为20 nm，长为50～700 nm，宽为60～800 nm.

Fig.5 SEM images of capillary column uncoated(A)and coated(B)chiral MOC-PA

手性MOC-PA固定相是否均匀地涂覆在毛细管内壁是实验成功的关键之一，因此，对涂覆好的毛细管色谱柱进行了SEM分析，并与未涂覆的毛细管柱进行对比.由图5可见，内壁涂覆了一层均匀的手性MOC-PA材料的涂覆柱的毛细管内壁不光滑，而未涂覆的毛细管柱内壁则较光滑.

2.2 手性MOC-PA色谱柱的电渗流

为了测试手性MOC-PA色谱柱的手性识别能力，对其进行了性能探究.首先采用缓冲体系为pH=7.5，浓度为100 mmol/L的流动相探究了电压与产生的电流之间的关系，将电压由6 kV逐步增加到22 kV，以得到的电压和电流绘制线性图，发现二者呈线性关系，经计算R=0.999，说明产生的电流随着电压的增加而增大.

另外，对于毛细管电泳，除了考察电压与电流的关系，其手性识别能力与产生的电渗流也有重要关系.电渗流的大小与手性固定相是否涂覆在毛细管内壁密切相关，因此需要测试未涂覆毛细管柱与已涂覆的毛细管在不同的pH值下所产生电渗流的大小.选用硫脲作为电渗流标记物，如图6所示，在pH=3.5～8.5范围内，分别多次测量空柱与涂覆柱的电渗流，并在曲线中添加相应的误差棒.图中未涂覆柱产生的电渗流略大于涂覆柱，是因为硅羟基的解离程度不同，未涂覆的毛细管柱由于内壁没有涂覆物，导致硅羟基解离程度大于涂覆柱，产生的电渗流大于涂覆柱产生的电渗流，表明手性MOC-PA已涂覆在毛细管内壁.

Fig.6 Variation of column electroosmotic flow of chiral MOC-PA chiral column with pH(A)and error bar(B)

2.3 手性MOC-PA色谱柱对位置异构体的拆分

首先通过拆分位置异构体对手性MOC-PA色谱柱进行性能测试.以电压为15 kV，pH=7.5，100 mmol/L的Tris-H3PO4缓冲液作为拆分条件，成功拆分了硝基苯酚，说明该手性固定相与硝基苯酚存在相互作用，由于硝基苯酚的分子结构和大小不同，导致与固定相接触产生的作用力不同，最终使得硝基苯酚达到基线分离.由表1可知，硝基苯酚得到不同程度的分离，硝基苯酚间位和对位的分离度为2.65，间位和邻位的分离度为9.03，说明手性MOC-PA色谱柱具备良好的分离性能.

Table 1 Resolution of enantiomers on chiral MOC-PA column

2.4 手性MOC-PA色谱柱对手性药物的拆分

以100 mmol/L Tris-H3PO4缓冲溶液作为流动相，4种手性药物1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻在手性MOC-PA色谱柱上得到了一定程度的分离，表明该材料具有良好的手性识别能力.实验中手性MOC-PA作为手性固定相，它是一种具有四面体结构的有机笼状多孔材料，每个有机笼分子都有手性.电泳分离时，手性药物与有机笼分子之间可能存在立体构型匹配作用、偶极-偶极作用、π-π键和氢键等作用，当手性药物经过毛细管色谱柱内壁时，在诸多作用下手性药物得到了一定程度的分离.然而，由于手性药物分离的过程是一个十分复杂的问题，很难完全阐明手性分离的机理.表2列出了4种手性药物的迁移时间（tR）、理论塔板数（N）、分离因子（α）和分离度（Rs）.4种手性药物的分离条件为15 kV，100 mmol/L，pH=7.5，拆分谱图如图7所示.

Table 2 Resolution of chiral drugs on chiral MOC-PA column

Fig.7 Separation spectrograms of chiral drugs on chiral MOC-PA column（A）1，2-Diphenylethylene glycol；（B）Zopiclone；（C）4-methyldiphenylmethanol；（D）Anise.

2.4.1 分离电压对手性药物的拆分影响选用浓度为100 mmol/L，pH=7.5的Tris-H3PO4缓冲体系，通过改变分离电压分别探究了分离1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻4种手性药物的最佳电压值，结果如表3所示.

Table 3 Resolution of chiral compounds at different separation voltages

由表3数据可知，1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻4种手性药物的最佳分离电压均为15 kV.由于工作电压的增加，手性色谱柱内的电渗流也随之增大.当电压从13 kV增加到15 kV，1，2-二苯基乙二醇的分离度从1.35增加至1.39，佐匹克隆的分离度从3.20增加至4.92，4-甲基二苯基甲醇的分离度从1.74增加至1.83，茴香偶姻的分离度从2.00增加至2.10，可见分离度随着电压的增加而增大.随着电压由15 kV增加到17 kV时，1，2-二苯基乙二醇的分离度从1.39降至1.14，佐匹克隆的分离度从4.92降至3.57，4-甲基二苯基甲醇的分离度从1.83降至1.78，茴香偶姻的分离度也从2.10降至1.52.从出峰时间的长短来看，分离电压不仅影响手性药物的分离效率和分离度的大小，而且影响出峰时间，电压越大，出峰时间越短，表明电压对毛细管电泳的分离效果具有重要影响.

2.4.2 缓冲溶液浓度对手性药物的拆分影响为了探究缓冲溶液的浓度对手性药物的拆分影响，选用pH=7.5，电压为15 kV和不同浓度的Tris-H3PO4缓冲溶液体系进行实验.

如表4所示，缓冲溶液浓度不同时，对手性药物的分离度也不同.当浓度为50 mmol/L时，茴香偶姻没有得到分离；当浓度从50 mmol/L升高到100 mmol/L时，1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻的分离度随之增加.但将缓冲溶液浓度从100 mmol/L升高到150 mmol/L时，分离的手性物拆分效果却有所降低.由此得出100 mmol/L是分离4种手性药物的最佳缓冲液浓度，其分离度分别为1.39，4.92，1.83和2.10.从出峰时间来看，浓度越高，出峰时间变得越长.缓冲溶液黏度会随着浓度的增加而增大，导致电渗流减小，分离度和分离因子得以提高.但浓度过高时，反而会降低手性药物的分离度和分离因子.

Table 4 Resolution of chiral drugs in different buffer solutions

2.4.3 缓冲溶液pH值对手性药物拆分的影响缓冲溶液pH值对毛细管的表面特性影响较大，在pH=4～6时，Si—OH基团的电离非常敏感，也影响毛细管中电渗流的大小.pH值越高，Si—OH基团的电离度越大，甚至趋于饱和，电渗流也随之变大；pH值降低时，电离受到抑制，电渗流也会降低，甚至趋近于零.由此可知，pH值影响着电渗流和出峰时间，出峰时间随着pH值的升高而减小，不同pH值对手性药物的拆分程度也不同.在浓度为100 mmol/L，电压为15 kV的不同pH值的Tris-H3PO4缓冲体系中进行实验，筛选最佳的溶液pH值.图8为4种手性药物在不同pH值下的拆分谱图.可见，当pH值从6.5增至8.5时，佐匹克隆的分离度降低；当pH值从6.5增至7.5时，1，2-二苯基乙二醇、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻的分离度都增大；再将pH值增至8.5时，茴香偶姻的分离度降低，1，2-二苯基乙二醇和4-甲基二苯基甲醇无法被拆分.结果表明，在pH=6.5时，佐匹克隆的分离度最高；在pH=7.5时，1，2-二苯基乙二醇、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻的分离度最高.

Fig.8 Electrochromatograms of chiral compounds at different pH values on chiral MOC-PA column（A）1，2-Diphenylethylene glycol；（B）Zopiclone；（C）4-methyldiphenylmethanol；（D）Anise.

2.5 手性MOC-PA毛细管色谱柱的重现性和稳定性评价

以佐匹克隆为测试物，选用电压为15 kV，pH=6.5的100 mmol/L的缓冲溶液，考察了手性MOC-PA毛细管柱的稳定性及重现性.结果表明，连续5次进样，佐匹克隆保留时间的相对标准偏差（RSD）为5.3%.分别制备了3根毛细管柱R1，R2和R3，在同样的色谱条件下进样，计算出其保留时间的标准偏差（RSD）为3.4%.以上结果说明手性MOC-PA柱有良好的重现性和稳定性.

3 结论

采用一锅法分别合成了配体H2LPA和手性MOC-PA，利用手性MOC-PA制备了手性毛细管电泳柱，考察了其对手性药物的拆分能力.结果表明，该柱对1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻4种手性药物和位置异构体硝基苯酚具有一定的拆分能力.通过探索1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻4种手性药物的最佳分离条件，得出1，2-二苯基乙二醇、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻的最佳分离条件为15 kV，100 mmol/L，pH=7.5；佐匹克隆最佳分离条件为15 kV，100 mmol/L，pH=6.5.它们的分离度（Rs）分别为1.39，11.82，1.83和2.10.综上所述，手性MOC-PA是一种极具潜力的毛细管电泳手性固定相，在手性分离领域有较好的发展前景.