涂 青，杨双全，章之柱，陈秋慧，卢红梅，徐海粟，仇治艳，陈 莉*

（1.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 化学与化工学院，贵州 贵阳 550025）

1817年，瑞典化学家BERZELIUS J发现并命名了硒元素[1]，之后人们逐渐认识到硒对人和动物的益处。1973年，世界卫生组织将硒列为人体必需微量元素[2]，硒主要以有机硒和无机硒两种形式存在[3]，经研究发现其具有提高免疫、防癌、拮抗重金属、抗氧化、抗肿瘤、保护细胞等作用[4-7]。硒在不同地区土壤中的含量有着十分明显的差异，我国有72%的地区普遍缺硒[8]，30%的地区严重缺硒[9]，缺硒与克山病密切相关[10]，并可能导致儿童大骨节病[11]。中国营养学会建议我国成人膳食硒参考摄入量为60 μg/d[12]，硒摄入不足或摄入过量都会对人体造成不利影响，天然富硒食品无法满足需求，因此要寻找合适的富硒产品来满足人体对硒的需要[13]。富硒食品根据硒的富集途径和方法可以分为天然富硒食品和人工转化富硒食品[14]。天然富硒食品主要是依托作物在富含无机硒的土壤中经过自身生物转化形成富含有机硒的原料生产而得，比如富硒茶、富硒大米、富硒大蒜等，富硒猕猴桃等产品[15]。人工转化主要是指利用植物、动物、微生物等作为转化子，利用其将无机硒转化成有机硒，进而加工生产富硒食品[16]，比如富硒鸡蛋、富硒牛奶、富硒猪肉等。天然富硒食品受土壤环境的影响很大[17]，富硒水平常常不稳定。因此，研究更多的趋向于利用人工转化。

富硒酵母作为一种有机硒来源，比无机硒具有更高的生物利用率和更好的安全性，是一种理想的补硒制剂，应用前景广阔，可以作为富营养添加剂应用于保健食品中，同时也可以作为发酵剂制备富硒食品[18-19]。目前关于富硒酵母的研究主要集中在菌种选育、实验室培养优化等方面，用于富硒的酵母菌主要为酿酒酵母、产朊假丝酵母等[20]，从自然环境中筛选到的富硒酵母，一般富硒能力较弱，培养过程中获得生物量比较低，因此研究人员通过对菌株进样诱导、优化酵母营养物质及培养方式来提高富硒酵母富硒量及生物量[21-26]。本课题组前期从开阳地区富硒桑葚果园中分离培养得到的一株富硒酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SY2，经研究发现，该菌株具有良好的富硒特性和发酵性能，有很好的开发应用潜力[20]。本研究以富硒酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SY2为发酵菌种，通过优化发酵工艺提高菌体的生物量，同时比较溶氧反馈补料与拟指数补料两种方式对富硒酵母生长及硒转化率的影响，从而确定适宜补料方式。旨在为富硒酵母的工业化应用提供理论依据，同时也对富硒酵母在食品领域的开发利用起到积极推动作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

富硒酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SY2：本实验室筛选、保藏。

1.1.2 化学试剂

硒标液（硒含量为1 000 μg/mL）：国家有色金属及电子材料分析测试中心；生物素（分析纯）：上海纯优生物科技有限公司；盐酸硫胺、邻苯二胺（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；糖蜜（总糖51.8%，还原糖12.7%，总氮2.3%，灰分12%）：广西糖业集团有限公司；3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氢氧化钠（均为分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；碳酸钠（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；亚硒酸钠（分析纯）：郑州诚旺化工产品有限公司；浓硫酸、硝酸、甲苯（均为分析纯）：重庆川东化工有限公司；乙二胺四乙酸二钠（ethylenediamine tetraacetic acid-2Na，EDTA-2Na）（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司。

1.1.3 培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）液体培养基：酵母浸出粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，121 ℃灭菌20 min备用。

发酵培养基：稀释处理后糖蜜（以含糖量计）50.0 g/L、硫酸铵3.0 g/L、磷酸二氢钾1.1 g/L、硫酸镁2.0 g/L、盐酸硫胺8.0 mg/L、生物素0.4 mg/L。115 ℃灭菌20 min。硒母液0.120 g在无菌坏境下加入灭菌后培养基。

补料培养基：稀释处理后糖蜜（以含糖量计）200.0 g/L、硫酸铵6.0 g/L、磷酸二氢钾2.2 g/L，115 ℃灭菌20 min。硒母液0.120 g在无菌坏境下加入灭菌后培养基。

硒母液：称取4.381 1 g亚硒酸钠蒸馏水定容于100 mL，0.22 μm过滤除菌，低温保存备用。

1.2 仪器与设备

Biostat B 5 L发酵罐：德国贝朗国际生物工程公司；ZD-2A自动电位滴定仪：上海大普仪器有限公司；L5S 紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；SMART生物显微镜：重庆奥特光学仪器有限公司；SPX-250B生化培养箱：上海琅玕实验设备有限公司；ZD-85A气浴恒温振荡器：常州朗越仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

糖蜜预处理：将糖蜜用蒸馏水稀释至（25±5）°Bx，用硫酸调节pH值至4.5左右，加热煮沸，搅拌通风30 min，加石灰乳调节pH至5.0，75 ℃恒温静置8 h以上，取上清液[27]。

种子液制备：将低温保存的甘油管富硒酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SY2菌液在30 ℃培养箱融化，取1 mL接种于100 mL的酵母浸出粉胨葡萄糖（YEPD）液体培养基，于30 ℃、160 r/min摇床恒温培养12 h，得到种子液。

1.3.2 富硒酵母发酵工艺优化

在前期优化培养基的基础上（即1.1.3中发酵培养基），利用5 L发酵罐分批发酵培养富硒酵母。发酵条件为：30 ℃，初始pH 4.5，接种量8%，硒母液添加量20 mg/L，装液量为2 L/5 L，调节转速（200～600 r/min），通气量（4～8 L/min）控制溶氧量30%以上，使用碳酸钠（1mol/L）和稀硫酸（1 mol/L）控制发酵过程pH值为4.5，循环水控温，消泡泵自动消泡。每隔2 h取样检测发酵液活菌数，生物量不再增加或者开始降低为发酵终点。以富硒酵母生物量、硒转化率为评价指标，确定初始pH、发酵温度、接种量、硒添加量、发酵时间等发酵条件。每组实验做3组重复。

1.3.3 富硒酵母补料方式研究

以优化后发酵工艺在5 L发酵罐发酵，每隔2 h取样，测定酵母SY2的干质量和残糖含量，绘制酵母SY2生长曲线和糖消耗曲线，以Logistic方程对其生物量进行拟合得出拟合生长曲线，以Luedeking-Piret方程对糖消耗量进行拟合得到糖消耗曲线[28]。根据糖消耗曲线确定补料的时间，进行拟指数补料、溶氧反馈补料2种方式补料，并以酵母生物量、酵母对糖蜜的得率，发酵液乙醇含量，硒转化率等指标评价不同的补料方式，确定合适的补料方法。

拟指数补料：拟指数补料是一种根据菌体比生长速率制定补料速率的方法，选取适宜的比生长速率可以使菌体在较好的状态生长[29]。补料起始时间设定为发酵第15小时开始。控制溶氧量＞30%，pH、温度与优化后的发酵工艺一致。补料速率计算公式[30-31]如下：

式中：F为补料速率，L/h；YG为菌体得率，g/g；μ为设定比生长速率，h-1；ρsF为补料培养基总糖含量，g/L；ρs起始补料时残培养基糖质量浓度，g/L；V0，补料开始培养基体积，L；ρco，补料时菌体质量浓度，g/L；t为指数补料时间，h。考虑实际操作可行性，参照徐富增等[29]以时间差分法进行补料，即每隔2 h更改补料速率，t小时的补料速率为t～t+2的内平均速率。

溶氧反馈补料：溶氧反馈补料方式是根据设定的溶氧量值启动补料的方法。溶氧可以反映菌体生长快慢，当残糖充足并且菌体生长旺盛时，菌体耗氧增大，溶氧下降；糖含量不足时，菌体由于代谢迟缓，耗氧量减少，溶氧上升。溶氧反馈补料，可以使溶氧维持在较稳定水平，同时调节补料速率，使得菌体既不会因为糖浓度太高或溶氧不足产生溢流代谢生成乙醇，也不会因为糖浓度太低造成菌体生长停滞及死亡[32]。本实验设定溶氧量＞30%时启动溶氧反馈补料，其他条件及补料总体积与拟指数补料一致。

1.3.4 分析检测

（1）富硒酵母总硒含量的测定

硒标准曲线绘制：参照文献[33-34]，并做适当改动。准确吸取1 mL（硒含量1 000 μg/mL）硒标液加入锥形瓶，加入5 mL硝酸，加入玻璃珠，盖上小漏斗，过夜冷消化，再低温缓慢消化，直到不再冒黄棕色的烟，取下冷却。加入2 mL 30%H2O2，稍许加热后冷却，用100 mL容量瓶定容，得到硒标准溶液（10 μg/L）。分别吸取硒标准溶液0、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于锥形瓶中，各加入1.0 mL 5%EDTA-2Na，4 mL 10 g/L的邻苯二胺，加蒸馏水补齐体积至15 mL。用5 mol/L的NaOH调节pH至2.0，于暗处反应60 min。加入10 mL甲苯，保鲜膜封口，摇床振荡（120 r/min，5 min）。将其转移至比色管，静置5 min，取上层有机相待测，以甲苯为参比溶液，在波长334 nm处测得吸光度值。以硒质量浓度（x）为横坐标，波长334 nm处的吸光度值（y）为纵坐标绘制硒标准曲线，得到硒标准曲线回归方程：y=10.333 7x+4.249 9，相关系数R2=0.999 8。

富硒酵母总硒含量的测定：称取0.100 0 g冻干酵母粉，加入5 mL硝酸，消化操作同标样。消化液用50 mL容量瓶定容。吸取5.0 mL加入锥形瓶，随后操作同上。将测得吸光度值代入标准曲线回归方程，求出硒含量。

酵母残留无机硒的测定：称取冻干酵母粉1.0 g，加入约25 mL水，超声溶解10 min，用50 mL容量瓶定容，摇匀。测定步骤同上。将测得吸光度值代入标准曲线回归方程，求出硒含量。酵母硒转化率按计算公式如下：

（2）还原糖及乙醇含量测定

参照文献[35]用DNS法测定还原糖；参照文献[36]的重铬酸钾氧化法测定乙醇含量，并做适当改进。

（3）发酵液活菌数检测

将发酵液稀释适宜的倍数，取0.1 mL稀释液加入0.9 mL次甲基蓝染色液，混匀，室温下染色10 min，立即在显微镜下血球计数板计数[37]。无色透明的细胞数乘以稀释倍数即为活菌数。

（4）富硒酵母生物量的测定

以菌体干质量为生物量指标，取一定量的发酵液离心后，弃上清，用蒸馏水洗涤沉淀，再离心。反复洗涤沉淀3次。将沉淀进行真空冷干燥，冻干得到的菌粉称质量即为富硒酵母生物量。

1.3.5 数据处理

数据处理用SPSS 23.0，Fisher单因子多重比较对实验数据进行方差分析，用不同字母表示同一因素不同水平之间差异显著（P＜0.05）；MATLABR2016b进行模型拟合，实验设计用Design-Expert 11.0.3，绘图用Sigma Plot 14.0。

2 结果与分析

2.1 富硒酵母发酵工艺优化

以富硒酵母生物量、硒转化率为评价指标，确定初始pH、发酵温度、接种量、硒添加量、发酵时间等发酵条件，结果见图1。

由图1A可知，初始pH值为3.5～4.5时，富硒酵母生物量随之增加；在初始pH值为4.5时，富硒酵母生物量最大，为9.22 g/L，但与初始pH值为5.0时富硒酵母生物量差异不显著（P＞0.05）；在初始pH值为4.5和5.5时，富硒酵母生物量有所下降。硒含量和转化率均在pH 5.0时取得最大值。因此，选择最适初始pH值为5.0。

由图1B可知，在发酵温度为28～30 ℃时，富硒酵母生物量、硒转化率随之增加；在发酵温度为30 ℃时，富硒酵母生物量、硒转化率最大，分别为8.80 g/L、76.133%；在发酵温度为30～34 ℃时，富硒酵母生物量、硒转化率有所下降。富硒酵母硒含量在30 ℃达到最大值后，趋于稳定不再增大。因此，选择最适发酵温度为30 ℃。

由图1C可知，在接种量为2%～8%时，富硒酵母生物量、硒转化率随之逐渐变大；当接种量为8%时，富硒酵母生物量、硒转化率达到最大值；当接种量为8%～10%时，富硒酵母生物量、硒转化率有所下降，但不显著（P＞0.05）；硒含量在接种量10%时最高。因此，选择最佳接种量为8%。

由图1D可知，随着硒的添加量在20～50 mg/L范围内增大，富硒酵母生物量和硒转化率均随之逐渐降低，其中生物量在硒添加量为20～30mg/L时，降低趋势不显著（P＞0.05）；硒含量随着硒添加量在20～40 mg/L范围内的增大而增大，在硒添加量为40～50 mg/L时趋于稳定。因此，选择最佳硒添加量为30 mg/L。

由图1E可知，在发酵时间为16～24 h时，富硒酵母的生物量、转化率、硒含量随之增加；在发酵时间为24 h时，富硒酵母的生物量、转化率、硒含量最高，分别为9.25 g/L、78.50%、2 283.36 μg/g；在发酵时间为24～36 h时，富硒酵母的生物量、转化率、硒含量均趋于稳定。因此，选择最佳发酵时间为24 h。

图1 初始pH（A）、发酵温度（B）、接种量（C）、硒添加量（D）及发酵时间（E）对富硒酵母SY2生物量硒含量及硒转化率的影响Fig.1 Effect of initial pH (A),fermentation temperature (B),inoculum (C),selenium addition (D) and fermentation time (E) on biomass,selenium content and selenium conversion rate of selenium-enriched yeast SY2

综上所述，通过实验确定富硒酵母最适发酵工艺为初始pH值5.0，发酵温度30 ℃，接种量8%，硒添加量30 mg/L，发酵时间24 h。

2.2 富硒酵母SY2补料培养方式研究

2.2.1 富硒酵母SY2生长动力学及糖消耗动力学曲线

由图2可知，在0～5 h，酵母处于延迟期，在5～15 h，酵母细胞处于对数期，生长快速，代谢活跃；在15～20 h，菌体达到稳定期，细胞不增加，生物量趋于稳定；20 h后，随着营养物质耗尽，代谢物积累，细胞生长停滞，发酵结束后，菌体生物量为9.77 g/L。与生长曲线相对应，在延迟期，糖消耗速率较低，残糖变化幅度较小，进入对数期后，糖被菌体快速消耗，浓度迅速降低，进入稳定期及衰退期后，糖含量稳定在较低水平，发酵结束后残糖含量为6.66 g/L。菌体对糖蜜的利用率为0.195 4 g/g，与拟合方程计算值相近。

图2 富硒酵母SY2生长动力学及糖消耗动力学曲线的拟合Fig.2 Fit of growth kinetic and carbohydrate consumption kinetic curves of selenium-enriched yeast SY2

2.2.2 富硒酵母SY2拟指数补料培养

根据实验数据及拟合方程的参数，对富硒酵母进行拟指数、溶氧反馈补料研究。拟指数补料设定的比生长速率按最大比生长速率的1/2，即0.193 h-1，根据生长及糖代谢曲线，补料起始时间为发酵第15小时开始，拟指数补料培养的流加速率变化见图3，酵母培养过程见图4。

图3 拟指数补料培养的流加速率变化Fig.3 Change of the flow rate of quasi-exponential feed-batch culture

图4 拟指数补料富硒酵母SY2培养过程Fig.4 Culture process of selenium-enriched yeast SY2 with quasi-exponential feed-batch

由图3可知，随着发酵时间增长，补料速率逐步上升。拟指数补料从发酵的第15小时开始，补料速率为0.05 L/h，发酵第26小时停止补料，此时补料速率为0.30 L/h。

补料从分批发酵对数期结束开始，补料时富硒酵母生物量为9.5 g/L，残糖为6.0 g/L。由图4可知，随着补料的速率的增大，菌体快速增长，菌体生物量在培养32 h达到最大值30.6 g/L；菌体对糖的利用速率小于流加的速率，所以残糖浓度逐渐上升，在26 h停止补料之后开始下降，发酵结束后残糖为15.6 g/L；发酵液中乙醇含量随着残糖的增加在后期开始上升，在26 h达到最大乙醇含量9.5 g/L。整个培养周期为34 h，富硒酵母得率为0.252 g/g，发酵结束酵母硒含量为1 920.5 μg/g，硒的转化率为82.7%。

2.2.3 富硒酵母SY2溶氧反馈补料培养

设定溶氧值＞30%时启动溶氧反馈补料，富硒酵母SY2培养过程见图5。

由图5可知，随着溶氧反馈补料启动，在15～42 h内，富硒酵母生物量快速增加，残糖含量有稍微上升，在42～46 h内，富硒酵母生物量达到稳定不再增加，残糖含量处于较稳定水平，发酵结束后菌体生物量达到36.5 g/L。在整个补料过程中，发酵液中乙醇含量均处于较低和稳定的水平，在发酵38 h时达到最高3.0 g/L。发酵结束后，残糖含量为15.0 g/L；溶氧反馈补料培养周期为46 h，富硒酵母得率为0.317g/g，富硒酵母硒含量为1759.5μg/g，硒转化率为90.1%。

图5 溶氧反馈补料富硒酵母SY2培养过程Fig.5 Culture process of selenium-enriched yeast SY2 with dissolved oxygen feedback feed-batch

2.2.4 富硒酵母SY2不同培养方式比较

不同发酵方式富硒酵母SY2发酵参数比较结果见表1。由表1可知，拟指数补料与溶氧反馈补料培养相比较，发酵周期短，生产强度较高，酵母硒含量较高，在生产实践中更有优势。同时，与分批发酵相比，拟指数补料与溶氧反馈补料富硒酵母生物量分别提高2.12倍、2.74倍，菌体得率分别提高29.2%、62.6%，硒转化率分别提高6.7%、12.6%。但是硒含量均出现不同程度的降低，分别降低23.5%、34.8%，这可能是由于相较于分批发酵，富硒酵母生物量大量增加，有更多的富硒酵母参与转化外部环境的硒，导致硒含量反而下降。

表1 不同发酵方式富硒酵母SY2发酵参数比较Table 1 Comparison of fermentation parameters of selenium-enriched yeast SY2 with different fermentation methods

3 结论

以5 L发酵罐进行富硒酵母发酵，确定其最适发酵工艺为：初始pH5.0，发酵温度30℃，接种量8%，硒添加量30 mg/L，发酵时间24 h。在此优化条件下，富硒酵母生物量为9.8 g/L，硒转化率为77.5%。在此基础上，进行拟指数补料与溶氧反馈补料方式发酵，与分批发酵相比，拟指数补料与溶氧反馈补料的富硒酵母生物量分别提高2.12倍、2.74倍，菌体得率分别提高29.2%，62.6%，硒转化率分别提高6.7%，12.6%；但是硒含量均出现不同程度的降低，分别降低23.5%，34.8%。与溶氧反馈补料相比，拟指数补料的发酵周期短，生产强度较高，生产效率较高，在生产实践中更有优势。