白诗睿 ，马志杰 ，梅 萨 ，陈生梅 ，陈付菊 ，郭卫兴

（1.青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016；2.农业农村部青藏高原畜禽遗传育种重点实验室，西宁 810016；3.青海省高原家畜遗传资源保护与创新利用重点实验室，西宁 810016；4.青海大学农牧学院，西宁 810016；5.青海省果洛州班玛县畜牧兽医站，青海 班玛 814399）

牦牛是生活在青藏高原高寒牧区的牛族物种，享有“高原之舟”和“全能家畜”的美誉[1]。青海省是我国牦牛存栏数最多的省份，被誉为“世界牦牛之都”。青海省果洛藏族自治州平均海拔在4 200米以上，是纯牧业州，牦牛是其优势的家畜遗传资源，牦牛产业在其诸产业中居于支柱地位和母体地位，承担着促进当地畜牧业可持续发展和实现群众共同脱贫致富的重任。线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）被广泛用于哺乳动物群体遗传结构、多样性及系统发育等研究[2]。当前，已有研究者对我国6个牦牛主产区的多个牦牛品种（群体）进行了母系遗传探究，如赖松家等[3]分析了我国5个牦牛品种的mtDNA D-loop区全序列，表明我国牦牛遗传多样性丰富且存在2个母系起源。郭松长等[4]研究表明，我国多数牦牛品种表现出丰富的遗传多样性且存在较大的遗传多样性差异，揭示牦牛有2个母系起源。Wang Z.F.等[5]研究表明，家、野牦牛单倍型多样度均较高且存在3个母系支系，其中第Ⅲ支系仅包含少量野牦牛，家、野牦牛共享第Ⅰ和Ⅱ支系。随后，钟金城等[6]、成述儒等[7]、官久强等[8]、Yue X.P.等[9]、李静等[10]及Li G.Z.等[11]先后分析了西藏、甘肃、四川、新疆和青海的多个牦牛品种（群体）的母系遗传多样性、群体结构及系统发育等，表明各省（自治区）多数牦牛品种（群体）的母系遗传多样性水平较高，有2个母系起源，且发现在天祝白牦牛和互助白牦牛中存在普通牛的基因渗入。最近，王兴东等[12]对青海和新疆的5个牦牛品种（群体）进行mtDNA全序列分析，发现牦牛存在3个不同的母系支系，且家、野牦牛共享这3个支系。李广祯等[13]对野牦牛及青海4个地方牦牛品种的mtDNA全序列进行综合分析，表明野牦牛和青海4个地方牦牛品种间遗传分化较弱，但其母系遗传多样性均较高，也确定了3个母系支系，推测牦牛有3个母系起源。

综上，虽然研究者已对我国多个牦牛品种（群体）的遗传多样性、群体结构和系统发育等进行了较为系统的探究[3-21]，但尚无对青海省果洛藏族自治州牦牛群体母系遗传研究方面的系统报道。本研究对青海省果洛州3个牦牛群体（达日、玛沁和岗龙牦牛）进行mtDNA D-loop序列综合分析，以明确其母系遗传多样性水平、系统发育关系和分化状况等问题，以期为青海省牦牛遗传资源的发掘、保护和育种规划的制订奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 采样与基因组DNA提取

采用分户随机采样方式，在青海省果洛藏族自治州甘德县岗龙乡共采集33头（15♂，18♀）牦牛血液样品（ACD抗凝），确保样品间无亲缘关系且具有代表性。使用由北京艾德莱生物科技有限公司提供的全血基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，后-20℃保存备用。

1.2 PCR扩增与测序

参照先前野牦牛的研究报道[14]，合成1对mtDNA D-loop区序列引物来扩增岗龙牦牛群体的该序列，其中上游引物为5′-GTAAAGAGCCTCACC AGTAT-3′，下游引物为5′-TCCTCTAGCCATTGAC TAT-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反应采用25 μL体系，包括超纯水9.5 μL、基因组DNA 1 μL、2× Premix 12.5 μL和上、下游引物各1 μL。PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，31个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR纯化产物送至北京擎科生物科技有限公司进行双向测序。

1.3 序列下载及数据分析

从GenBank中下载已报道的37条达日县达日牦牛的mtDNA D-loop序列（GenBank No.：DQ138998-DQ139034）和32条玛沁县玛沁牦牛的相应序列（GenBank No.：DQ139043-DQ139074）。同时，下载美洲野牛（Bison bison）的相应序列（GenBank No.：EU177871）以及牦牛3个母系支系的代表序列（即支系Ⅰ（GenBank No.：FJ548844）、支系Ⅱ（GenBank No.：FJ548843）和支系Ⅲ（GenBank No.：DQ139202）作为外群和参考序列[14]，结合本试验测定的33条甘德县岗龙牦牛的mtDNA D-loop序列，对共计102条序列使用BioEdit 7.2.5软件开展多序列比对，后用DnaSP 5.10.01软件确定3个牦牛群体的核苷酸序列多态位点以及单倍型数目，再使用Arlequin 3.5.2.2软件计算群体单倍型多样度、核苷酸多样度以及群体间固定分化指数（Fst）值大小。利用公式Nm=（1-Fst）/（4Fst），计算群体间基因流(Nm)值大小。采用Mega 5.05软件基于Fst值构建UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)树，以揭示3个牦牛群体间的遗传关系。以美洲野牛作为外群，基于Mega 5.05软件的邻接法(neighbor-joining,NJ)和Network 10.1软件的网络中介图(median-joining,MJ)构建单倍型(组)间的系统发育树，进而揭示3个牦牛群体单倍型（组）间的系统发育关系。

2 结果与分析

2.1 3个牦牛群体母系遗传多样性分析

通过对达日、玛沁和岗龙3个牦牛群体638 bp mtDNA D-loop序列比对分析，排除22处插入（缺失）位点后，共检测到42处多态位点（图1），包括35处简约信息位点和7处单一多态位点。研究共确定了32种单倍型，其中达日、玛沁和岗龙牦牛分别检测到17、13和18种单倍型，各自拥有特有单倍型8、6和8种。3个牦牛群体共享的单倍型有6种，包括H1、H3、H10、H11、H12和H13，而达日牦牛和岗龙牦牛共享3种单倍型（H9、H15和H17），玛沁牦牛和岗龙牦牛只共享H19单倍型。遗传多样性指数计算结果显示，达日、玛沁和岗龙牦牛的单倍型多样度分别为0.901±0.034、0.887±0.033和0.951±0.019，核苷酸多样度分别为0.016±0.008、0.012±0.006和0.029±0.015。3个牦牛群体总的单倍型多样度为0.921±0.014，核苷酸多样度为0.020±0.010。

图1 青海省3个牦牛群体32种mtDNA D-loop序列单倍型核苷酸变异、频率大小及单倍型组类型Figure 1 Nucleotide variations,frequencies and haplogroup types of 32 haplotypes based on mtDNA D-loop sequence variations of three Qinghai yak populations

此外，将3个牦牛群体与已报道的我国其他18个牦牛品种（群体）遗传多样性指数值进行比较分析（表1），结果表明青海省果洛藏族自治州的这3个牦牛群体遗传多样性指数值仍都较高，表明其母系遗传多样性相对丰富。

表1 青海省3个牦牛群体与我国18个牦牛品种（群体）母系遗传多样性指数值比较Table 1 Comparisons of genetic diversity indexes among three yak populations in this study and other 18 Chinese yak breeds/populations

2.2 3个牦牛群体间遗传分化及聚类分析

为揭示3个牦牛群体间的分化程度及基因交流情况，对群体间固定分化指数（Fst）值和基因流（Nm）值大小进行计算。结果表明（表2），岗龙牦牛与达日、玛沁牦牛间的Fst值分别为0.118和0.129，Nm值分别为1.869和1.688，而达日牦牛和玛沁牦牛间的Fst值仅为0.021，Nm值为11.655。利用群体间Fst值构建UPGMA树（图2），结果显示达日牦牛与玛沁牦牛先聚为一类，而后与岗龙牦牛再聚为一大类。

表2 青海省3个牦牛群体间Fst值（下三角）及Nm值（上三角）大小Table 2 Fstvalue(lower triangle)and Nmvalue(upper triangle)among three Qinghai yak populations

图2 基于UPGMA法构建的青海省3个牦牛群体间聚类关系Figure 2 Clustering relationships among three Qinghai yak populations based on UPGMA method

2.3 3个牦牛群体系统发育分析

对3个牦牛群体中确定的32种单倍型构建系统发育树（图3）。结果显示，32种单倍型明显地分为2个大的分支（支系），其中Ⅰ支系包括25种单倍型，隶属A、B和E单倍型组，占比为78.13%；Ⅱ支系包括7种单倍型，属C和D单倍型组，占比为21.87%。从单倍型组构成来看，A、B、C、D和E 5种单倍型组分别占59.38%、15.62%、9.38%、12.5%和3.12%，其中A单倍型组包括H3、H4、H6、H7、H8、H10、H12、H14、H15、H18、H19、H20、H22、H26、H27、H28、H29、H30和H32共19种单倍型，B单倍型组包括H2、H13、H17、H24和H25单倍型，C单倍型组包括H5、H9和H31单倍型，D单倍型组包括H1、H16、H21和H23单倍型，而E单倍型组仅包括H11单倍型。此外，达日牦牛单倍型个体隶属于A、B、C、D和E 5种单倍型组，占比分别为52.94%、17.64%、11.77%、11.77%和5.88%；玛沁牦牛单倍型个体只隶属于A、B、D和E 4种单倍型组，所占比例分别为53.85%、15.38%、23.08%和7.69%；而岗龙牦牛单倍型个体也隶属于A、B、C、D和E 5种单倍型组，分别占 61.11%、16.66%、11.11%、5.56% 和5.56%。

图3 青海省3个牦牛群体母系单倍型（组）间系统发育关系Figure 3 Phylogenetic relationships among haplotypes/haplogroups of three Qinghai yak populations

3 讨论

遗传多样性研究有助于人们更清晰地认识家畜的起源和进化历史，进而为其遗传资源的保护、育种策略制定和遗传改良奠定基础。本研究首次对青海省果洛藏族自治州的3个牦牛群体（即达日、玛沁和岗龙牦牛）进行了母系遗传多样性分析，在确定的32种单倍型中，发现达日、岗龙牦牛均拥有特有单倍型8种，玛沁牦牛也拥有特有单倍型6种，说明这3个牦牛群体均拥有特殊的母系遗传信息。在遗传多样性指数分析中，与野牦牛及国内其他家牦牛品种相比[3-21]，3个牦牛群体总的单倍型多样度值较高（0.921±0.014），其中岗龙、达日牦牛群体的单倍型多样度均较高（0.951±0.019和0.901±0.034），而玛沁牦牛的单倍型多样度相对较低（0.887±0.033），说明这3个牦牛群体总的母系遗传多样性水平较高，但岗龙牦牛和达日牦牛群体的母系遗传多样性相比玛沁牦牛更为丰富。究其原因，可能与各群体间选择强度、遗传漂变、群体结构组成及近交程度等因素存在差异有关。

群体间的遗传分化程度可根据其Fst值大小来评估，其值越大则群体间分化程度越大。而基因流作为反映群体间基因交流程度大小的指标，与Fst值大小正好相反。正所谓Nm值越大，Fst值就越小，提示群体间的基因交流就越频繁，分化程度就越弱，反之亦然。根据S.Wright[22]的研究，当群体间Fst值在0～0.05、0.05～0.15和0.15～0.25范围，则说明群体间遗传分化程度分别为很弱、中等及较大，而Fst值大于0.25则说明群体间遗传分化程度极大。本研究中，岗龙牦牛与达日、玛沁牦牛间的Fst值分别为0.118和0.129，Nm值分别为1.869和1.688，而达日牦牛和玛沁牦牛间的Fst值仅为0.021，Nm值为11.655，说明岗龙牦牛与达日、玛沁牦牛间分化程度均呈中等遗传分化水平（0.05＜Fst＜0.15），基因交流相对贫乏，而达日和玛沁牦牛之间分化程度较弱（0＜Fst＜0.05），群体间基因交流相对频繁。

在3个牦牛群体的聚类分析中，达日牦牛首先与玛沁牦牛聚为一类，而后与岗龙牦牛再聚为1大类，表明达日牦牛和玛沁牦牛间亲缘关系较近，而它们各自与岗龙牦牛间的亲缘关系较远，该结果与上述群体间分化程度、基因流大小的研究结果一致。

牦牛的系统发育研究可以明确其遗传背景，对其遗传资源的保护和开发利用具有重要指导作用。先前大量牦牛母系系统发育的研究结果显示：牦牛由2个母系支系组成，推测其有2个母系起源[3-4,6-11,15-20]。然而，Wang Z.F.[5]、王兴东等[12]、李广祯等[13]、Ma Z.J.等[14]和白诗睿等[21]基于线粒体基因组及其D-loop区、蛋白编码序列的研究发现家、野牦牛均拥有3个母系支系，其中大量家、野牦牛个体共享第Ⅰ、Ⅱ支系，而第Ⅲ支系中只检测到少量野牦牛、雪多牦牛和格尔木牦牛个体，推测牦牛可能有3个母系起源。本研究结果表明，青海省果洛州的达日、玛沁和岗龙牦牛3个牦牛群体均由2个母系支系（Ⅰ和Ⅱ）组成，推测其均存在2个母系起源，这与先前报道中对我国大多数家牦牛品种（群体）的研究结果[3-13,15-20]吻合。

4 结论

青海省果洛州3个牦牛群体均拥有特有的母系遗传信息，岗龙、达日牦牛群体相比玛沁牦牛具有更丰富的母系遗传多样性；岗龙牦牛与达日、玛沁牦牛群体间遗传分化程度较高，遗传关系较远，而达日牦牛和玛沁牦牛间分化水平较低，遗传关系较近；各群体均由2个母系遗传分支组成，推测其均有2个母系起源。