孟祥忍 高子武 王恒鹏 屠明亮 吴丹璇 高苏敏 刘宗振

酱卤牛肉是中国传统肉制品的重要代表，深受人们的喜爱，而“老卤”的使用是其风味独特的重要原因之一。一般来说，至少循环煮制20次的卤汤称“老卤”[1]，含有丰富的游离氨基酸、核苷酸等滋味物质[2]，赋予了牛肉醇厚的滋味，进而形成独特的风味。老卤中风味物质种类繁多且复杂，对其综合分析较为困难。臧明伍等[3]利用SPME-GC-O-MS技术分别对清真酱牛肉在预煮、煮制1 h、煮制完成及浸泡冷却4个加工阶段的风味物质进行测定，认为以醚、醛类为主体风味物质。李素等[4]使用吹扫捕集—热脱附—气相色谱—质谱联用法探究了卤汤牛肉在贮藏期内挥发性风味物质的变化规律，并确定了壬醛、对茴香醛和辛酸为卤汤牛肉的主体风味物质。李娟等[5]采用气相色谱—质谱联用法探究了北京老字号酱牛肉风味物质的组成与贡献，确定了桉叶油醇、芳樟醇、草蒿脑、壬醛、茴香脑5种特征性风味物质。

目前，酱卤肉制品风味强度的评判多根据感官指标，但感官评定具有较强的主观性。主成分分析法可以根据各指标的相关性和变异程度来确定权重[6]，可以减少主观确定各指标权重的弊端，是一种客观的评价方法，被广泛应用于盐水鹅[7]、羊肉[8]、茶叶[9]等食品的风味评价中。国内外有关卤牛肉的研究多集中于单次卤煮过程中品质变化和不同阶段工艺的优化，而关于循环卤煮牛肉特征性风味物质的研究尚未见报道。研究拟采用固相微萃取结合气相色谱—质谱联用技术定性定量分析循环卤煮牛肉的风味物质，结合相对气味活度值(ROAV)筛选其关键性风味物质，并采用主成分分析法建立循环卤煮牛肉特征性风味强度的评价模型，旨在为后期更客观评价其特征性风味提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲁西黄牛金钱腱：饲养条件一致，12月龄，宰后成熟72 h，平均体重(500±10) kg，山东华胜清真肉类有限公司；

食用盐、香辛料、黄酒等：食品级，市售。

1.2 仪器与设备

电子天平：FA2104型，万特衡器电器有限公司；

电磁炉：GC-20XCAa型，广东格力电器股份有限公司；

气相色谱仪：TraceISQII型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

石英毛细管柱：DB-Wax型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 循环卤煮工艺流程 参照唐春红等[2]的方法适当修改。

(1) 卤汤：相对于肉重计算，350.00%的纯净水中加入1.00%盐、1.50%生抽、1.00%老抽、4.00%料酒、1.00%葱、1.00%姜、0.15%八角、0.07%山奈、0.03%小茴香、0.07% 香叶、0.06%草果、0.03%甘草、0.15%桂皮、0.01%丁香，煮沸保持10 min后将香料捞出，即配成卤汤。

(2) 循环卤制：将牛腱肉修整后去除表面筋膜与脂肪，重量控制在(400±5) g，按牛肉质量计算，3.00%盐均匀涂抹于牛腱肉表面，0～4 ℃静置腌制24 h，冷水入锅进行焯水，沸腾保持5 min后捞出清洗冷却，加入煮沸的卤汤中，并在微沸状态下(电磁炉加热功率500 W)卤制60 min，取出牛腱肉。每次卤煮结束后将卤汤冷却过筛，去除表面油脂及碎渣，称重后按比例补充水分以及调味料再次煮沸，按m牛腱肉∶m水为1.0∶3.5加入新牛腱肉，重复操作完成不同卤煮次数的卤牛肉。

1.3.2 样品处理 每次卤煮结束后，卤牛肉冷却至室温。每个卤煮循环取样1次，选取5个具有代表性的取样点进行数据分析，取样点分别为第1，5，10，15，20次，依次标记为L1、L5、L10、L15、L20。

1.3.3 挥发性风味物质测定 参照Zhou等[10]的方法并适当修改。萃取头老化温度250 ℃；老化时间1 h。称取3 g卤牛肉样品切碎后放入顶空萃取瓶(20 mL)，置于恒温水浴锅中，将萃取头插入至萃取瓶中，55 ℃水浴40 min。色谱条件：色谱柱为DB-Wax(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)，检测器温度250 ℃，载气为氦气，流速1.5 mL/min。起始柱温40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升温至150 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升温至180 ℃，以10 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min。质谱条件：离子源温度230 ℃，电离方式EI+，电子能量70 eV，扫描质量范围30～550 (m/z)。采用保留指数定性，挥发性风味物质含量通过面积归一法以峰面积百分含量表示。

1.3.4 风味评价 参照刘登勇等[11]的方法，按式(1)计算相对气味活度值(ROAV)。

(1)

式中：

ROAVi——相对气味活度值；

Ci——挥发性物质的相对百分比含量，%；

Ti——挥发性物质的感觉阈值，μg/kg；

CMAX——所有风味物质中最大的相对百分比含量，%；

TMAX——所有风味物质中最大的感觉阈值，μg/kg。

1.3.5 感官评定 确定12名感官评价员(6男6女)，均为食品学院师生。分别称取卤肉样品5 g，随机放在已编号的感官杯中，将样品水浴加热至(45±2) ℃。评分标准：90～100分为强烈卤牛肉风味；80～89分为卤牛肉风味明显；70～79分为中等强度卤牛肉风味；60～69分为轻微卤牛肉风味；0～59分为几乎无卤牛肉香味。

1.3.6 数据处理 利用SPSS 22.0及SIMCA 14.1进行主成分分析及绘制载荷图，α为0.05。

2 结果与分析

2.1 循环卤煮牛肉中挥发性风味物质分析

由表1可知，卤牛肉中共检出64种挥发性风味物质，其中醛类5种、醇类25种、酮类7种、酸类4种、烃类4种、酯类9种、其他类10种，且醛、醇类物质占比较大。第1，5，10，15，20次卤汤制作的卤牛肉分别检出33，28，31，24，30种挥发性风味物质，峰面积占比分别为85.98%，87.72%，94.75%，95.04%，96.37%。随着卤煮次数的增加，卤牛肉的挥发性风味含量逐渐增加，主要是因为卤煮过程中牛肉蛋白水解和脂肪氧化[12]，导致游离脂肪酸和游离氨基酸等部分风味前体物增加，从而转化为风味物质，赋予了牛肉更加丰富的风味。

醛类物质阈值较低，具有脂肪香气，主要来源于脂肪氧化和氨基酸Strecke反应[13]，对卤牛肉风味的贡献较大。循环卤煮牛肉中醛类物质相对含量最高，第1～20次卤汤制作的卤牛肉中其相对含量从43.29%增加至63.63%。这可能是由于肉中的不饱和脂肪酸和脂肪发生氧化降解并融入了卤汤中[14]。循环卤煮牛肉中壬醛和正己醛的产生主要源于油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸的氧化[15]，其中正己醛所占峰面积最大，呈青草和清新味，能增加味感[16]，在循环卤煮次数增加的过程中，其含量呈先下降后上升的趋势，在卤煮第10次时趋于平缓。壬醛在各卤牛肉中均有检出，呈玫瑰香、柑橘香等香型[17]。醇类物质主要来源于不饱和脂肪酸氧化和醛类的还原[17]。在卤汤循环卤制过程中，峰面积占比第二的物质是醇类物质。卤煮第20次卤汤制作的卤牛肉中的醇类含量低于卤煮第1次的。其中芳樟醇主要来源于卤水中添加的香辛料，乙醇主要来源于料酒，循环卤煮过程中这两种醇含量降低，可能是发生了挥发、氧化和脂化反应。酮类物质阈值较高，主要来自于美拉德反应和不饱和脂肪酸热氧化，对卤牛肉风味贡献较小[17-18]。循环卤煮过程中，峰面积占比最少的为酮类物质，仅为2.21%。酯类化合物阈值较低，主要由醇类与酸类的酯化反应产生，可赋予肉制品酯香味、甜味和果味[18]。第1～20次卤汤制作的卤牛肉中酯类物质相对含量从2.18%降低至0.86%，主要是在循环卤煮过程中，酯类物质发生降解，而降解产生的化合物与美拉德中间产物等反应，进而生成其他类化合物所致[19]。烃类物质阈值较高，其形成主要来源于脂肪氧化[20]。在反复卤煮过程中烃类物质含量逐渐升高，是因为卤牛肉中的脂肪酸发生氧化，卤牛肉中的烃类物质逐渐被卤汤吸收，而后随着循环卤煮次数的增加卤汤中的烃类物质逐渐浸入到牛肉中，进而使卤牛肉中的烃类含量逐渐上升。

表1 牛肉循环卤煮过程中挥发性风味物质的相对含量和ROAV值†Table 1 Analysis results of volatile flavor compounds and corresponding ROAV in the process of cyclic stewed beef

续表1

由表1可知，5组卤牛肉中有5种风味物质均被检出，分别为正己醛、十一醛、壬醛、正己醇和3-甲基戊烷。其中正己醛在卤牛肉中检出含量较高且ROAV值均大于1.00，为卤牛肉的关键挥发性风味物质，与邵俊锋等[21]、谢伟等[22]的结论一致。十一醛、壬醛、正己醇和3-甲基戊烷的ROAV值为0.10～1.00，表明其对卤牛肉的整体风味具有修饰作用。桉叶油醇的ROAV值分别在L5、L10、L15和L20中最大，茴香脑ROAV值在L1中最大，这两类物质可能与卤水中添加的香辛料有关[22-23]，能促进卤牛肉风味的形成。

2.2 循环卤煮牛肉特征性风味的主成分分析

将5组卤牛肉样品中检出的27种特征风味物质(ROAV≥0.10)构成5×27的矩阵，进行主成分分析，得到相关矩阵的特征值及累计贡献率。根据特征值大于1和累计贡献率达到85.00%以上的原则确定主成分个数[23]。由图1和表2可知，前3个主成分的方差贡献率分别为52.40%，25.64%，12.95%，累计方差贡献率为90.98%，且特征值均大于1，表明前3个主成分能解释循环卤煮牛肉中特征风味的大部分信息，能够代表循环卤煮牛肉特征性风味物质的基本信息。

由表3和图1可知，第1主成分的贡献率最大的是X2(十一醛)，其对应的特征值为0.96，第1主成分与X1、X2、X6、X9、X13、X15、X32、X41、X48、X52、X53、X59、X60呈正相关，与X3、X18、X19、X20、X21、X33、X34、X54、X63呈负相关。芳樟醇、异松油烯、茴香脑、4-丙烯基-2-甲氧基苯酚等来源于香料，正己醛、十一醛、反式-2-已烯-1-醇、正辛醇、反式2-己烯基己酸等来源于酯类物质的分解。第2主成分的贡献率最大的是X14(4-萜烯醇)，其对应的特征值为0.94，主要反映X6、X9、X14、X15、X18、X53、X60的变异信息。4-萜烯醇存在于豆蔻中，4-丙烯基-2-甲氧基苯酚存在于丁香中，其余大部分物质也来源于香辛料，表明第2主成分代表了牛肉中香料的风味。第3主成分的贡献率最大的是X8(正己醇)，其对应的特征值为0.89，主要反映X8、X16、X24、X32的变异信息，这些醇酮类物质主要由酯类物质降解、氧化而来[18]。各主成分的方程式分别为：

图1 主成分分析碎石图和散点图Figure 1 Principal component analysis macadam and scatter

表2 相关矩阵的特征值和累计贡献率Table 2 Eigenvalues and cumulative contribution rate of correlation matrix

表3 主成分的特征向量Table 3 Eigenvectors of principal components

F1=0.85X1+0.96X2-0.78X3+…+0.72X59+0.71X60-0.85X63，

(2)

F2=-0.14X1+0.05X2+0.59X3+…+0.70X59+0.70X60+0.49X63，

(3)

F3=-0.19X1-0.13X2+0.190X3+…-0.04X59-0.00X60+0.19X63。

(4)

由于前3个主成分反映了原来指标信息的90.98%，且原来多个指标较为复杂，故可用这3个新综合指标进行分析。选择不同特征的方差贡献率βi(i=1，2，…，k)为加权系数[23]，利用综合评价函数F=(β1F1+β2F2+…+βkFk)/0.91建立卤牛肉特征性风味评价模型：

F=(0.52F1+0.26F2+0.13F3)/0.91。

(5)

根据式(5)计算不同循环卤煮牛肉样品特征性风味评价得分，并依据评分大小对循环卤煮牛肉样品特征性风味强度进行评定，结果见表4。由表4可知，L1的F值最小为-0.79，L20的F值最高为0.48。

由图2可知，各样品组的第1主成分得分相差较小，L5和L10位置靠近，说明其挥发性风味成分相似，第5次和第10次卤汤制作的卤牛肉中挥发性风味物质变化缓慢，香味成分逐渐趋于稳定。L1、L5、L10位于主成分2的负值区域，L15、L20 位于正值区域，5组循环卤煮牛肉被主成分2明显区分开来，表明卤汤的卤煮次数对卤牛肉风味的影响较大。

2.3 循环卤煮牛肉特征性风味强度感官评分

由表5可知，卤汤循环卤煮的次数对牛肉的特征风味强度有较大影响，随着循环卤煮次数的增加，牛肉的特征风味强度评分上升。其中，循环卤煮第20次的牛肉特征风味最强，但其评分与循环卤煮第15次的较为接近，因此可以推断卤汤循环卤煮次数达到第15次时，卤牛肉特征风味已趋于稳定，后续试验可在循环第15次的条件下继续改进。在循环卤煮牛肉特征性风味强度感官评分中，特征风味最强的为L20，最低的为L1，与模型评价的结果相似。

表4 循环卤煮牛肉特征性风味强度评分Table 4 Characteristic cycle spiced boiled beef flavor intensity grading

2.4 牛肉循环卤煮过程中特征性风味主成分评分与感官评分的相关性分析

由表6可知，感官评分与F值之间的相关系数高达0.90，具有显著相关性(P<0.05)，且二者排序均与模型相等，表明特征风味强度模型与感官评价法具有良好的一致性，表明采用主成分分析法初步构建牛肉特征性风味强度评价模型较为可靠和适用。

图2 循环卤煮牛肉特征性风味主成分得分图Figure 2 Principal component score map of characteristic Flavor of circulating boiled Beef

表5 循环卤煮牛肉特征性风味强度感官评价†Table 5 Cycle characteristic spiced boiled beef flavor intensity sensory evaluation results

表6 循环卤煮牛肉感官评分与F值的Pearson相关性分析†

3 结论

为构建循环卤煮牛肉的风味强度模型，对不同卤煮次数卤汤制作的卤牛肉中的挥发性风味物质进行了测定，共检测出64种风味物质，其中醛类物质相对含量最高，醇、酯、酮、酸、烃类物质次之。根据风味物质的相对气味活度值所处范围分析循环卤煮牛肉的关键性风味物质，其中正己醛、十一醛、壬醛、正己醇、3-甲基戊烷、桉叶油醇、茴香脑等为循环卤煮牛肉的关键性风味物质。同时采用主成分分析法对具有一定贡献的风味物质进行分析，构建了循环卤煮牛肉特征性风味强度评价模型为F=(0.52F1+0.26F2+0.13F3)/0.91，且与传统感官评价结果具有显著相关性，说明利用主成分分析法构建的循环卤煮牛肉评价模型适用性较强，对后续感官评价结合仪器指标评价风味强度具有一定的参考价值。但由于影响牛肉特征性风味的因素较多，如牛肉的新鲜程度、牛肉卤煮次数的梯度设置、卤汤的品质问题等，后续可进一步细分梯度来提高循环卤煮牛肉风味评价模型的精确性。