冯献君， 吴英华， 史 艳， 侯雷平， 李梅兰

(山西农业大学园艺学院，山西太谷 030801)

菜心(L. ssp.var.Tsen et Lee)别称菜薹，是十字花科芸薹属白菜亚种中的一个变种，在华南地区广泛栽培，而在我国北方地区属稀有蔬菜。近年来，随着社会发展和人员的流动，菜心的栽培范围逐渐扩大，栽培区域逐渐北移。菜心以幼嫩的薹茎和花蕾为可食用部位，而花薹的发育决定其产量和品质。目前关于花薹营养物质积累方面的研究较少，主要集中在花薹形成的调控机制中。蔗糖、葡萄糖和果糖等可溶性糖是菜心花薹中重要的营养物质，其中葡萄糖和果糖在菜心的甜度及口感方面起重要作用，它们在蔗糖转化酶的水解作用下进一步转化成己糖磷酸酯参与细胞代谢，因此蔗糖转化酶在调节菜心各个器官的营养品质形成(尤其是糖的累积利用)中是必不可少的。

植物通过光合作用固定碳源，产生植物生长发育所需的营养物质，并从源器官运输到库器官中，而蔗糖是主要的产物之一。蔗糖在降解过程中的关键酶是蔗糖转化酶和蔗糖合成酶，其中蔗糖转化酶的作用不可逆。Barratt等研究表明，蔗糖转化酶在植物生长发育和初级氮代谢中至关重要。根据亚细胞定位将蔗糖转化酶分为细胞壁蔗糖转化酶(CWINV)、液泡蔗糖转化酶(VINV)和细胞质蔗糖转化酶；根据最适pH值又可分为酸性蔗糖转化酶和中性蔗糖转化酶。前二者属于酸性蔗糖转化酶，后者属于中性蔗糖转化酶。中性转化酶活性较低且不稳定，酸性蔗糖转化酶属于-呋喃果糖苷酶，是糖基水解酶家族 32(GH32)的成员之一，其在植物生长发育及蔗糖代谢中发挥关键作用。

近年来，酸性蔗糖转化酶已在玉米、拟南芥、番茄等植物中广泛研究，蔗糖转化酶在菜心中的相关研究较少。因此，本研究对菜心酸性蔗糖转化酶基因家族成员进行鉴定，从理化性质、染色体定位、系统进化树、蛋白质的二级结构以及保守基序进行分析，以期为进一步探索菜心酸性蔗糖转化酶的多样性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

本试验于2021年7月在山西农业大学园艺学院实验室完成。

1.2 菜心酸性蔗糖转化酶基因家族鉴定及蛋白质的理化性质分析

先从拟南芥信息资源网站(TAIR)(http：//www. Arabidopsis. Org)找到拟南芥中已鉴定的8个酸性蔗糖转化酶家族基因及氨基酸序列，再根据笔者所在实验室已有的转录组数据并结合大白菜全基因组数据库(BRAD)进行同源搜索，初步筛选得到菜心蔗糖转化酶基因家族成员。通过NCBI-CDD数据库分别对所有基因序列进行保守结构域检查，删除不完整序列，最终获得菜心酸性蔗糖转化酶基因。利用相同的方法分别鉴定得到13个甘蓝、9个水稻、8个黄瓜的酸性蔗糖转化酶基因。对筛选得到的菜心酸性蔗糖转化酶家族蛋白质序列，使用在线软件ExPASy(http：//www.expasy.org/)进行理化性质的分析。

1.3 基因家族系统进化树分析

使用MEGA 7.0软件对菜心、拟南芥、甘蓝、水稻和黄瓜酸性蔗糖转化酶家族蛋白质序列进行比对，构建系统发育树。利用在线软件iTOL(http：//itol.embl.de/)修饰美化进化树。

1.4 基因染色体定位

菜心酸性转化酶基因染色体定位图使用在线工具MG2C(http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)绘制。

1.5 蛋白质的二级结构预测及亚细胞定位

菜心酸性蔗糖转化酶家族蛋白质二级结构的预测使用在线软件SOPMA(http：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)进行。亚细胞定位通过在线工具CELLO(http：//cello.life.ntcu.edu.te/)进行。

1.6 基因家族结构及蛋白质保守基序分析

菜心酸性蔗糖转化酶基因结构的分析使用在线软件GSDS(http：//gsds.gao-lab.org/index.php)进行。使用在线软件MEME(https：//meme-suite.org/meme/tools/meme)和TBtools软件绘制蛋白质保守基序图。

1.7 酸性蔗糖转化酶基因表达分析

根据菜心不同器官的转录组数据，分析酸性蔗糖转化酶家族基因在各个器官中的表达情况。

2 结果与分析

2.1 菜心酸性蔗糖转化酶基因的染色体定位分析

为了探讨菜心酸性蔗糖转化酶基因在染色体上的分布，使用在线软件MG2C信息可视化网站分析，可知菜心的13个酸性蔗糖转化酶基因分布在A01、A03、A04、A05、A06、A09和A10号染色体上(图1)。这13个酸性蔗糖转化酶基因不均匀地分布在7条染色体上。其中定位在A09号染色体上的基因最多，有3个。A01和A10号染色体上定位的基因最少，均为1个，其余4条染色体上均定位到2个基因。

2.2 菜心酸性蔗糖转化酶基因家族的系统进化树分析

为了进一步探究菜心酸性蔗糖转化酶基因的进化关系，使用MEGA 7.0软件选用甘蓝、水稻、黄瓜和拟南芥的酸性蔗糖转化酶家族基因为参考序列构建系统发育树。结果(图2)显示51个蔗糖转化酶基因分为2类，分别为液泡蔗糖转化酶基因()、细胞壁蔗糖转化酶基因()。其中拟南芥有2个液泡蔗糖转化酶基因，6个细胞壁蔗糖转化酶基因；菜心有4个VINV，9个CWINV；甘蓝有3个VINV，10个CWINV；水稻有6个CWINV，3个VINV；黄瓜仅有1个VINV。从系统发育树中可以看出拟南芥已知的酸性蔗糖转化酶基因及其对应的菜心基因均聚在一个分支上，说明它们的进化关系较近，结构和功能相似或相同。

2.3 菜心酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白质的理化性质

通过对菜心酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白质进行理化性质分析，发现其氨基酸数量、分子量、等电点、原子总数、不稳定系数、脂肪系数及亲水性均不一(表1)。菜心酸性蔗糖转化酶基因家族成员编码的氨基酸残基为418～800个，其中大部分都集中在500～650个之间。分子量为47.49～90.38 ku，与氨基酸数量变化趋势一致。等电点(pI)为4.96～9.19，其中液泡蔗糖转化酶基因家族蛋白的pI均小于7.5，说明液泡蔗糖转化酶基因家族蛋白均属于酸性蛋白。当蛋白质的不稳定系数大于40时，容易降解。菜心酸性转化酶家族蛋白的不稳定系数只有1个大于40，其余均小于40，为稳定蛋白。脂肪系数在69.19～82.31之间。亲水性均为负值，说明所有蛋白质都是亲水性蛋白。

2.4 菜心酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白质的二级结构预测及亚细胞定位分析

菜心酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白质是由 α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲构成(表2)，主要为无规则卷曲和延伸链。各蛋白质的二级结构均表现为无规则卷曲>延伸链>α-螺旋>β-转角。无规则卷曲占比在49.90%～56.75%之间，α-螺旋占比在12.75%～19.94%之间，延伸链占比在21.25%～28.80%之间，β-转角占比在4.60%～6.46%之间(表2)。

表1 菜心酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白质理化性质

表2 菜心酸性蔗糖转化酶家族蛋白二级结构预测及亚细胞定位分析

菜心酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白质亚细胞定位预测结果(表2)表明，液泡蔗糖转化酶基因家族蛋白和细胞壁蔗糖转化酶基因家族蛋白质定位于细胞壁、周质及外膜上，推测菜心酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白在这3个地方发挥作用。

2.5 菜心酸性蔗糖转化酶家族基因的结构分析

参考大白菜基因组数据库得到菜心蔗糖转化酶蛋白质序列对应的基因序列及蛋白质编码区(CDS)序列，并确定了其内含子和外显子的组成，构建了菜心酸性蔗糖转化酶家族基因的基因结构(图3)，图中黄色为菜心酸性蔗糖转化酶基因的CDS。从图3可以看出，菜心酸性蔗糖转化酶家族基因所含的CDS为3～9个，其中含有6、7个CDS的基因均有4个。含有9个CDS，和含有5个CDS，含有4个CDS，仅含有3个CDS。CDS数量有差异，表明菜心酸性蔗糖转化酶基因结构存在多样性。

2.6 菜心酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白质的保守基序分析

为了进一步研究菜心酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白质的结构特征及蛋白多样性，使用在线软件MEME对菜心酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白保守基序进行分析，确定了10个保守基序(motif1～motif10)类型。由图4可知，13个菜心酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白质均含有motif 1、motif 2、motif 4、motif 5、motif 8和motif 10。有8个蛋白质含有所有的保守基序，说明菜心酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白保守性较高。、和不含有motif 9，和不含有motif 6，不含有motif 3、motif 6 和motif 7。4个液泡蔗糖转化酶基因家族蛋白中有3个均含有10个保守基序，9个细胞壁蔗糖转化酶基因家族蛋白中有5个均含有10个保守基序，表明液泡蔗糖转化酶基因家族蛋白的保守性要高于细胞壁蔗糖转化酶基因家族蛋白。成员的保守基序排布不同，构成了蛋白质的多样性。

2.7 酸性蔗糖转化酶家族基因表达模式分析

利用菜心不同器官转录组数据分析酸性蔗糖转化酶家族基因在叶片、薹茎和花蕾中的表达特征，结果(图5)表明，13个基因均至少在1个器官中表达，其中有10个基因在各个组织中均有表达，和在薹茎中有很高的表达量，在花蕾中有很高的表达量，说明这些基因在菜心薹茎和花蕾营养物质积累中具有重要作用。此外，部分基因在不同部位中存在特异性表达，如和在花蕾中特异性表达。

3 讨论与结论

近年来，众多的研究表明，酸性蔗糖转化酶在植物生长发育、营养物质分配及表达调控方面发挥着关键作用，进而提高植物的产量及品质，这为人们研究植物中酸性蔗糖转化酶基因奠定了基础。植物中糖的代谢和积累与其产量和品质密切相关，蔗糖是高等植物光合作用的主要产物之一。本研究通过对比拟南芥酸性蔗糖转化酶基因家族，在菜心中鉴定出13个酸性蔗糖转化酶基因家族成员，数量上与拟南芥、番茄相近。

通过生物信息学分析软件对菜心酸性转化酶家族基因进行理化性质分析，发现13个菜心酸性转化酶基因家族蛋白质成员的氨基酸数量为418～800个，其中的为418个，少于其他的基因。酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白的氨基酸数量有很大差异，主要是由于外显子和内含子数量不同导致的，植物中该基因的典型结构包括7个外显子和6个内含子。因此、这2个细胞壁蔗糖转化酶基因蛋白氨基酸数量少是由于有4个外显子，有3个外显子。与其他酸性蔗糖转化酶差异明显，说明CWINV4()和CWINV5()存在外显子丢失情况。从酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白序列的保守基序来看，大部分基因中都包含10个保守基序且排序一致，说明菜心酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白质具有高度保守性。通过分析酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白的理化性质发现液泡蔗糖转化酶的等电点低于细胞壁蔗糖转化酶。相关研究表明，高等植物中低等电点的酶为液泡蔗糖转化酶，高等电点的酶为细胞壁蔗糖转化酶，且分别定位到液泡和细胞壁，本研究中通过亚细胞定位将菜心酸性蔗糖转化酶基因家族蛋白质定位在细胞壁、外膜和周质上，表明这些基因在细胞壁、外膜和周质中发挥作用。

本研究利用拟南芥8个酸性蔗糖转化酶家族基因作为参考序列，根据笔者所在课题组已有的菜心转录组数据结合大白菜全基因组数据库对菜心所有酸性蔗糖转化酶家族基因进行鉴定，识别出了13个菜心酸性蔗糖转化酶基因家族成员，它们的氨基酸数量大部分为500～650个，分子量变化与氨基酸数量变化趋势一致。其蛋白质二级结构无规则卷曲所占比例最高。13个基因中有8个基因均含有10个保守基序。系统发育分析结果显示，这些基因分为2类，其中菜心细胞壁蔗糖转化酶基因()9个，液泡蔗糖转化酶基因()4个，它们不均匀地分布在7条染色体上，其家族中大部分基因均含有6个或7个外显子。13个酸性蔗糖转化酶基因在菜心薹茎和花蕾中高表达的成员较多。这些结果有助于理解酸性蔗糖转化酶基因在菜心蔗糖代谢调控中的作用，同时也为探究酸性蔗糖转化酶基因多样性提供了数据基础。