唐雨楠，史陈晨，杨 明，盛奎川，张玺铭

（浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058）

细胞培育肉是指利用陆地动物（鸡、猪、牛、羊等）和海洋动物（鱼、虾、蟹、龙虾等）的细胞经体外增殖、分化用以替代传统食用肉类的组织（肌肉、脂肪、结缔组织），又被称为培养肉、培植肉、细胞肉、体外肉等。由于细胞培育肉洁净、安全、营养成分可调控且符合动物福利理念，因此又称清洁肉、定制肉、非动物肉、新蛋白肉等。

如今，世界人口持续增长、部分国家人均经济收入提升刺激肉品消费需求上涨。因此，越来越多的研究机构、业内企业开始关注细胞培育肉研究，以期填补传统屠宰肉品的供应缺口。除供需问题外，基于传统畜牧和渔业养殖生产肉品存在其他诸多问题与限制，如环境问题（土地和水体资源占用大、温室气体和污水排放多、养殖企业臭气排放衍生的邻避效应等问题）、食品安全问题（存在人畜共患病传染风险，过量使用激素、抗生素等）、生产效率问题（生产周期长、从饲料到肉品的能量转化率低、肉品占养殖所得个体体积比例低、生产过程易受动物瘟疫影响造成产量不稳定等）、食品营养风味问题（脂肪、胆固醇等比例难以调控等）、动物福利问题（屠宰等过程对动物造成诸多痛苦）。因此，亟需对细胞培育肉展开研究，获得环境友好、低碳高效、成分营养可调控的新一代蛋白，以实现对传统肉品的替代升级。

全球和我国第一块细胞培育肉分别在2013年由荷兰马斯特里赫特大学和2019年由南京农业大学制得。近年来，细胞培育肉领域发展迅猛，初创公司大量涌现，且商业化生产取得较大突破。世界范围内，美国Eat Just公司推出的细胞培养鸡块于2020年12月成为全球首款获批售卖的细胞培育肉商品；以色列Future Meat Technologies公司已实现高密度鸡肌肉细胞悬浮培养。2013年8月Mark Post教授研制出第一块细胞培养牛肉，这种牛肉制作的汉堡成本高达33万 美元/85 g，而2021年12月以色列Future Meat Technologies公司的细胞培养鸡胸肉造价仅为15.45 美元/kg（约为同期中国白条鸡售价的4～5 倍），细胞培育肉的成本显著降低，但距离替代传统畜牧养殖肉的最终目标仍有差距。为进一步降低细胞培育肉成本，需从细胞支架、非动物源培养基、生物反应器三方面进一步攻关。

细胞培育肉支架是具有特定结构、模拟细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的生物材料，可为肌肉、脂肪等细胞体外培养提供3D生长空间，同时促进细胞贴附、生长、增殖、分化甚至形成具有相应纹理和微观结构的整块组织。

细胞培育肉支架的研究至关重要，其原因在于：1）细胞培育肉的目标细胞是贴附细胞，其在体内对ECM、相邻细胞构成的环境敏感，在体外对接触的基质材料、培养基内的各种生长因子等环境同样敏感。比如，基质材料的部分性质（如过高的硬度、疏水性）可能造成细胞贴附困难、凋亡等。再如，支架的定向结构可诱导肌源细胞定向分化并获得肌管组织。因此，需要研究并优化支架的物理性质和结构，以使细胞良好、高效生长，并分化成目标组织。2）虽然支架已在组织工程等领域中得到较为成熟的研究与应用，但是细胞培育肉领域需要在支架的可食用性、成本、规模化生产潜力等方面进行更多考量，因此研究者需要针对细胞培育肉应用场景进行支架设计的优化与调控。

理想的细胞培育肉支架应满足如下需求：1）可支持细胞良好贴附、生长，这是最根本的需求。2）确保可分离、可降解或者可食用。值得注意的是，可食用支架是最理想选择，因为可食用支架可简化细胞培育肉的生产工艺，并且可辅助调控细胞培育肉产品的质构与口感。3）可提供一定的营养价值或膳食功能。4）具有良好的热稳定性，避免细胞培育肉在烹饪后结构和力学性能因支架分解而发生明显变化。5）可实现商业化、大规模生产，成本可接受。

已有细胞培育肉支架主要包括以下形式：1）多孔支架，即具有开放式孔隙的海绵结构支架；2）纤维支架，是由纳米纤维或微纤维构成的支架；3）微载体，即内部呈多孔状、纤维状或实心的球珠或不规则薄片，直径在几十到几百微米不等；4）水凝胶，是具有高持水率的、呈凝胶状的3D生物材料；5）生物墨水，是具有适宜流变特性的、容许细胞在其中生长并保护细胞免受机械伤害的、用于3D打印的生物材料。

从原料而言，已有细胞培育肉支架的材料主要集中在胶原或明胶、大豆蛋白、海藻酸盐、甲壳素或壳聚糖、琼脂糖、纤维素、透明质酸、去细胞化植物组织等。其中，胶原或明胶等动物蛋白对细胞的亲和力最佳，但是它们属于动物来源制品，而非动物源明胶的制备成本高，不是细胞培育肉支架原料的最优选择；大豆蛋白等植物蛋白具备优良细胞相容性且属非动物源材料，但是植物蛋白支架往往存在力学性能缺陷，常需要与其他材料复合使用；非动物源的甲壳素或壳聚糖、琼脂糖、纤维素、透明质酸等多糖类材料力学强度较大，但是生物相容性不及胶原或明胶等蛋白，通常需要进行化学改性或表面图案修饰；去细胞化植物组织从化学成分角度而言几乎相当于纤维素，但是其保留有植物的复杂结构，有助于细胞贴附、增殖或者可诱导细胞规则排列、分化。

纤维素作为细胞培育肉支架原料具有以下关键优势：1）纤维素丰富易得，是世界上含量最多的天然高分子多糖物质，广泛存在于植物细胞壁中，亦可通过微生物甚至动物获得；2）纤维素健康可食用，虽然纤维素无法被人体消化吸收，但是纤维素可以有效促进胃肠道蠕动，有益身体健康，同时纤维素属于美国食品药品监督管理局认证的“公认安全”（generally recognized as safe，GRAS）物质，在欧盟、中国、日本等地区同样被允许添加到食品中；3）纤维素可实现规模化制备，植物纤维素生产工艺早已在制浆造纸等行业中形成成熟体系，提供植物纤维素商品的知名公司包括挪威Borregard公司、日本Nippon Paper公司、加拿大Celluforce公司、加拿大Kruger公司、芬兰Stora Enso公司、美国American Process公司、芬兰UPM公司等。细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）在菌株、培养条件、生物反应器等影响产量的主要因素上已有众多筛选与优化，并且已成功实现工业化生产，如中国海南椰国食品有限公司、美国CP Kelco公司，以及日本San-Ei Gen公司、Kusano Sakko公司；4）纤维素颜色为白色或近白色，无味，便于调色调味，从而模仿肉类的感官品质。

纤维素支架在非细胞培育肉领域已有研究和应用基础。首先，纤维素在组织工程中已被广泛研究并作为支架材料。比如，纤维素支架可培养心肌细胞，生成类心脏结构组织；可培养MG-63骨肉瘤细胞用于骨组织工程；经丝胶蛋白修饰的BC可支持肠神经系统和肠道平滑肌细胞生长，用于肠道修复等。其次，已有纤维素支架实现商业化生产并应用于细胞体外培养、药物递送等。代表性纤维素支架商品包括Cytopore、Cellufine、MT、CelluForce NCC、BioCradle微载体、GrowDex水凝胶和GrowInk生物墨水。同时，已有初创公司推出专用于细胞培育肉的纤维素基支架，相关产品如澳大利亚Cass Materials公司的BC薄板、絮片和抓绒状微载体。

本文介绍纤维素的结构和基本理化特性，综述纤维素基生物材料的制备方法，并对纤维素在细胞培育肉支架中的应用挑战与应对策略进行总结和展望，旨在为纤维素基生物材料在细胞培育肉领域的开发与应用提供参考。

1 纤维素基细胞培育肉支架的原料

纤维素是由--吡喃型葡萄糖在1,4位以-糖苷键连结形成的无支链线性高分子物质，分子式为(CHO)，优势构象式如图1所示。纤维素具有结晶区和无定形区，前者占比大、生物可及性低，因此需要破坏结晶结构使纤维素易于改性。从化学结构看，纤维素富含羟基。具体而言，纤维素链其中一个末端葡萄糖基的C1位具有苷羟基，这一羟基作为隐性醛基而在一定条件下具有高反应活性；中间的每个葡萄糖基在C2、C3位具有仲醇羟基，C6位具有更易于反应的伯醇羟基。纤维素独特的化学结构为其降解、酯化、醚化、接枝共聚等反应提供了构象基础。同时，纤维素表面羟基基团带负电，并且有条件与其他物质形成氢键结合。因此，纤维素有望通过众多改性方式设计成具有多种功能的生物材料。

图1 纤维素链的优势构象Fig. 1 Dominant conformation of cellulose chain

1.1 植物纤维素

纤维素是植物细胞壁的主要成分，与半纤维素、木质素等伴生，共同起到支撑、保护细胞等作用。植物纤维素的常见分离方式为酸水解和机械处理。根据尺寸形态，提取的纤维素包括代表性的两类：纤维素纳米晶（cellulose nanocrystals（CNC）或cellulose nanowiskers（CNW）或nanocrystalline cellulose（NCC））和纤维素纳米纤维（cellulose nanofibers（CNF），亦称nanofibrillated cellulose（NFC））。CNC是长径比在10～100的棒状纤维素，主要由酸水解制得，其长度在50～500 nm，直径3～20 nm。CNF是长径比大于100的丝状纤维素，主要由机械处理制得，可辅以化学或酶预处理，其长度为500～10 000 nm，直径小于100 nm。

受来源植物、分离方式、测量方法等影响，纤维素的聚合度（degree of polymerization，DP）呈现很大差异，其中农业废弃物（如蔗渣、麦秸）纤维素的DP约为1 000，木材纤维素的DP约为4 000～5 000，棉花纤维素的DP则在10 000左右。此外，植物纤维素的结晶度约为40%～60%。

1.2 细菌纤维素

除植物外，纤维素也可来源于微生物发酵，即BC。椰果的主要成分即为BC，近年来风靡世界多国，被添加到饮料、糕点中或直接食用。BC具有天然高纯度、高结晶度（70%～80%）、高DP（可达8 000）、高含水率（99%）、良好的生物相容性和可规模化生产的特性，因而在食品、组织工程等领域受到越来越多的关注。BC是由特定类型的细菌发酵产生的纤维素。可生产BC的典型菌种是醋酸菌科的木醋杆菌（，曾先后归于Acetobacter、Gluconacetobacter），木醋杆菌也是研究BC合成的模式菌种。可生产BC的大部分微生物具有致病性或未应用于食品领域，因此在BC商业化生产中往往选择醋酸菌科细菌作为发酵培养对象。

静置培养的BC在培养体系气-液界面形成片层状凝胶膜，清洗后呈半透明乳白色。搅拌、振荡等非静态培养条件下，BC可呈现为球状、椭球状、星状、絮状或不规则团块状。电子显微镜下，BC具有3D网状纤维结构，纤维间隙在纳米级（直径约100～300 nm）。这一间隙对细胞而言过小，细胞无法进入材料内部并生长，因此用于细胞培育肉生物材料的BC必须经历结构调整。由于BC是微生物在运动状态下分泌的产物，其结构直接与微生物运动方式相关，因此可通过限制微生物的运动空间或运动方向而得到不同结构的BC，这可通过控制微生物发酵条件、生物反应器构造来实现。比如，用中心或/和外部透氧的管式生物反应器可得到形状类似血管的管状BC。

2 纤维素基细胞培育肉支架的制备方法

已有文献综述了细胞肉支架的制备方法，其中用于制备多孔支架的方法有颗粒浸出、熔融成型、冷冻干燥、发泡等；用于制备纤维支架的方法有湿法纺丝、静电纺丝、旋转喷射纺丝等；用于制备水凝胶的方法有酶促凝胶化、热凝胶化、光聚合和离子交联凝胶化等；3D打印、去细胞化、挤出成型等方法也可用于细胞肉支架制备；用于制备球形结构的方法有乳化、微流控等。上述制备方法中，可适用于纤维素（可能需要其他可食用材料辅助）的方法有冷冻干燥、发泡、酶促凝胶化、热凝胶化、光聚合和离子交联凝胶化、3D打印、植物去细胞化，其他方法因可能引入大量不可食用溶剂而不宜使用。以往文献主要从支架类型的角度进行介绍，而支架结构直接影响支架在细胞培育肉中的应用场景。因此，本文以支架的各关键结构为类别，按照多孔结构、球形结构、定向结构、天然精密结构、可定制结构，依次介绍以纤维素为原料的细胞培育肉支架制备方法。

2.1 多孔结构制备方法

为满足细胞3D培养，生物材料应当具有尺寸适宜的连通多孔结构。如果孔隙过小，细胞将无法迁移至材料内部，一些大分子营养物质运输也将存在问题；然而，如果孔隙过大，则细胞生产效率降低。因此，接近但略大于细胞尺寸的孔隙的制备方法在该领域得到广泛应用，常见方法包括冷冻干燥、发泡、牺牲材料、盐析等。

2.1.1 冷冻干燥法

冷冻干燥是材料造孔的常见手段之一，多用于制备多孔支架。其原理是：首先，在水凝固点以下，材料中的水分子冻结成冰晶，将周围的分子链排斥。然后，在高真空度下，冰晶直接升华为水蒸气离开体系，此前冰晶膨胀形成的孔洞得以保留。需要注意的是，整个材料基质中孔的尺寸均一性受降温速率制约，较慢的降温速率有助于形成均一的等轴晶粒，这将对无定向排列要求的细胞（如脂肪细胞）生长而言更有利。

Abraham等以水为溶剂，对乙酰化CNC进行冷冻干燥制备多孔支架，支架内孔径为0.1～10.0 μm，纤维素在冰模板的空间挤压下形成厚度为40～80 nm的相互连通的薄片层。遗憾的是，该研究并未验证生物相容性。

Xing Qi等用冻干法制备了纤维素微纤维-明胶多孔支架，冷冻温度为-20 ℃。所得支架内部孔径约为70 μm，孔隙率约为70%，杨氏模量在1～3 MPa（对应样品中纤维素含量50%～75%）。经过28 d培养，人间充质干细胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）在支架中增殖活跃，大量表达F-肌动蛋白和细胞外分子网络，并且呈现出沿纤维素纤维排列的趋势。随后进行诱导培养发现，支架允许hMSCs细胞成功分化为成骨细胞或脂肪细胞。然而，明胶源自动物，且研究中为使明胶交联而加入了不可食用的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide，EDC）和-羟基琥珀酰亚胺（-hydroxysuccinimide，NHS）。

冷冻干燥法简便易行，然而冷冻干燥法能耗大、成本高，如果应用到细胞培育肉生物材料制备中，将为培养肉终产品的造价额外增加一笔负担。同时，对于大体积样品，冷冻干燥法的效率低，且难以保证材料内部造孔均匀度。

2.1.2 发泡法

发泡法是向材料中加入在物理或化学作用下可产生气泡或释放气体的物质，从而在材料中造孔的方法。现有发泡剂包括物理发泡剂、化学发泡剂、表面活性剂。发泡法主要优点在于能够制备出清晰的多孔结构。然而其缺点包括：1）孔隙尺寸范围大，不易调控；2）易产生闭孔，孔隙连通性有限；3）孔隙分布不均匀。

物理发泡剂以超临界CO为代表。Ju Jiajun等利用超临界CO进行两步减压制备出具有双峰开放式孔隙结构的聚丁二酸丁二醇酯-CNC支架，其中含5% CNC的支架由直径分别为约68.9 μm和约11.0 μm的孔组成，具有较高的开放孔隙率（95.2%）。虽然该研究中的聚丁二酸丁二醇酯不在可食用范畴，但是物理发泡法本身不影响支架食用性，成本和能耗低，可实现工业化生产。对于化学发泡剂，其分解温度应低于纤维素及可食用衍生物（如羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose，CMC）、微晶纤维素（microcrystalline cellulose，MCC）、甲基纤维素（methyl cellulose，MC）、羟丙基甲基纤维素（hydroxypropyl methyl cellulose，HPMC））的初始分解温度（约为230～360 ℃），以保证纤维素生物材料主体的结构和力学性能完好。此外，考虑到细胞培育肉生物材料的可食用性，引入的发泡剂不应残留有毒有害物质或令人不快的味道和气味，本身应当允许添加到食品中。因此，仅有碳酸氢钠等少数发泡剂可供选择。同时，为获得开放式多孔生物材料，应注意发泡剂的种类选择、添加量与发泡工艺。

2.1.3 牺牲材料法

牺牲材料法是将非纤维素材料制成微球，并在纤维素生物材料制备过程中加入，以起到占位作用。待纤维素生物材料成型后，再将牺牲材料去除，从而留下与微球尺寸接近的孔洞。牺牲材料法与前述发泡法均可划归于使用致孔剂，但二者原理存在差异。发泡法是由致孔剂以物理或化学方式生成气体从而造孔，而牺牲材料法是致孔剂固体本身以物理方式占据空间，随后被除去从而造孔。牺牲材料法操作较为简单，但是通常需要高比例添加牺牲材料方可实现较高的孔隙率和孔的开放程度，因此如果牺牲材料无法回收并重复利用则损耗较高，并且牺牲材料成本将直接影响纤维素生物材料的造价。此外，对于细胞相容性欠佳的牺牲材料，应进行更为彻底的纯化操作以避免残留物影响纤维素生物材料培养细胞时的活性。

Bäckdahl等使用石蜡颗粒（直径90～500 μm）和土豆淀粉颗粒（直径5～100 μm）作为牺牲材料，将其加入的发酵体系中，待生成BC后去除牺牲材料颗粒得到多孔BC支架，用于培养平滑肌细胞。然而该支架纯化时需添加表面活性剂和酶，这将对支架的可食用性和成本造成不利影响。Yin Na等将琼脂糖微球作为牺牲材料嵌入逐层生长的菌膜中，得到多孔BC支架。

2.1.4 盐析法

盐析法，即以盐结晶（常用氯化钠）作为牺牲材料进行占位造孔的方法。相比于前述的牺牲材料法，盐析法成本更低，且易于纯化（用水即可浸出NaCl），不引入有毒有害的化学物质。Kanimozhi等将壳聚糖-聚乙烯醇-CMC用水复配，加入200～500 μm的NaCl颗粒后风干，再用水去除NaCl并风干，得到13.6～15.5 μm的多孔支架，该支架的孔径、孔隙率、孔开放程度均高于冷冻干燥法的对照组别。

2.2 球形结构制备方法

纤维素制备微球的常用方式包括乳化、微流控，这些方法在前人综述中已有充分介绍。Zhang Chunmei等采用油包水乳化结合冷冻干燥的方法制得聚乙烯醇/CNF多孔微球。该微载体的直径约为500 μm，孔径为25 μm，堆积密度为4.7 mg/cm，BET（Brunauer-Emmett-Teller）理论比表面积为44 m/g，孔隙率为99.6%。经NIH 3T3细胞测试，培养10 d后细胞在微球表面生长良好，部分细胞可迁移至微球内部孔隙中。该微载体的主要优势在于乳化工艺有利于实现大规模生产。然而，该微载体制备时使用的戊二醛交联剂不可食用，且甲苯油相存在残留隐患造成不可食用问题。

针对用于细胞培育肉的纤维素基球状生物材料制备，上述方法的主要问题在于需消耗大量溶剂，这些溶剂大多数无法食用或者去除工艺繁琐。如有残留不仅可能危害人体健康，还可能对材料的亲水性、粗糙度、表面电荷和官能团的暴露程度等表面性能产生负面影响，阴碍细胞在材料上的贴附与生长。此外，上述方法需结合其他方法使微球形态固定化，对于对酸、碱、温度、pH值相对不敏感的天然纤维素而言，辅助方法多为冷冻干燥。为此，可将上述方法与微生物发酵原位生成纤维素的方式相结合，从而避免溶剂问题。如首先通过微流控法或乳化法制得含有产BC细菌的明胶微球，再以此构建出空心微球空间供细菌生长，从而形成纤维素微球（图2）。此外，为规避有毒及难除溶剂问题，少数研究制备的纤维素微球可食用，但是颗粒直径往往偏大，如通过滴液法以NaOH水溶液为溶剂制得的纤维素微球，平均直径约在0.5～4.0 mm。微球直径过大将导致实心微球的比表面积降低，多孔微球的物质交换难度提升，不利于细胞的高效贴附与生长。

图2 原位生成纤维素微球[48-49]Fig. 2 In situ formation of cellulose microcarriers[48-49]

2.3 定向结构制备方法

定向冷冻、机械拉伸等方式均可形成各向异性生物材料。

2.3.1 定向冷冻

定向冷冻又名冷冻铸造，是在梯度温度场下水或盐溶液在固体材料内结成冰晶从而创造平行于温度梯度方向的定向通道的方法。其所创造的通道直径主要受冷冻温度因素影响。

Liaw等将羟基磷灰石与壳聚糖复合后进行定向冷冻，分别在2、5 ℃/min的降温速率下制备出直径为10～100、1～50 μm的支架内通道。另有研究将胶原蛋白溶液进行定向冷冻，降温速率为5 ℃/min，得到25～270 μm的支架内通道。

Dai Rengang等用液氮进行定向冷冻，制得各向异性丝素蛋白-CNC支架。随着CNC质量分数上升到0.8%，支架的平均孔径增大至17 μm。考虑到丝素蛋白同样可食用，丝素蛋白-CNC复合材料可作为细胞肉支架的原料。

Courtenay等以液氮为冷源，对阳离子化CNF进行定向冷冻，得到具有定向、平滑微通道的支架，通道孔径约为35 μm，纤维素壁厚约26 nm，杨氏模量可在不交联状态（0.1 MPa）到10%乙二醛交联（50 MPa）范围调整。在此基础上将Pickering乳液与定向冷冻相结合，可以向支架的纤维素壁层中引入相互连通的孔隙。MG-63细胞测试表明，培养7 d后细胞可在支架上存活。需要注意，虽然阳离子化试剂缩水甘油基三甲基氯化铵有利于细胞附着、交联剂乙二醛可增强支架力学性能，但是二者均不可食用。此外，该支架还使用其他不可食用有机物为溶剂，上述成分不应添加于细胞肉支架中。

与冷冻干燥法相类似，定向冷冻法以冰为牺牲模板，在支架内部创建定向通道，该方法简单、高效。但是随着样品体积增大（尤其是沿温度梯度方向的长度增加），确保样品内温度梯度的一致性将更加困难，造成通道孔径更加不均一（近冷源端样品局部温度梯度大，通道孔径小），从而导致良好的通道长度和通道孔径均匀度无法兼得。这一问题削弱了定向冷冻法大规模生产定向支架（尤其是用于整块肉的大尺寸支架）的潜力。

2.3.2 机械拉伸

机械拉伸法是对材料沿部分方向施加拉力，从而使材料沿拉伸方向具有更高取向性的方法。其定向效果受材料的力学性能（如弹塑性）、天然结构、拉伸方式等因素影响。该法的最大优点在于操作简单、快速，易于规模化。Wang Sha等对BC膜施加40%应力的湿拉伸，然后在60 ℃下热压以固定结构，从而获得高度定向排列的纤维结构（图3）。Mredha等在对单层材料进行线性机械拉伸的基础上，将多层已拉伸材料进行平行层叠、正交层叠、轴向卷叠、同心卷叠，获得4 种形式的具有各向异性结构与力学性能的3D材料。这可用于制备各向异性的纤维素细胞培育肉支架，进而生产可调控的、拥有多种纹理方向和多层次咀嚼感的全切肉。

图3 经40%应力湿拉伸的BC薄膜侧视图[60]Fig. 3 Side view of 40% wet-drawn bacterial cellulose film[60]

2.3.3 针对BC的定向方法

除上述方法外，对于BC可采取以下特定方式获得高取向性结构：在产BC微生物的发酵培养过程中，通过引入条纹沟槽状模板的方式将微生物的运动路径限制在单向通道内（模板法），或通过施加静电场的方式诱导微生物沿电场力方向运动（电场法），或通过使用外壁透氧的圆柱形搅拌式生物反应器（旋转搅拌法），均可原位生成定向的BC支架。将带有针状阵列的模具放入微生物培养体系中静态发酵（模具法），则可得到带有定向孔道的BC。

2.4 天然精细结构获取——植物去细胞化

去细胞法是指将细胞生物组织或器官中的细胞内容物去除以获取ECM的方法，近年来在组织工程与再生医学领域内得到持续关注。这种方法是直接获取而非模拟ECM，因此可获得其他生物材料难以比拟的生物相容性，并且其原料往往广泛易得。然而，如何完全去除DNA、RNA等可能引起免疫反应的异体乃至异种物质，同时尽可能多地保留ECM且不改变其结构原貌，有待更多研究。此外，去细胞化试剂多数不可食用，残留在用于细胞培育肉的生物材料中可能带来食品安全隐患。目前，去细胞化的主要研究对象是动植物而非微生物。从动物福利、生产成本、去细胞化操作难度等方面考虑，应用于细胞培育肉的去细胞化生物材料优先以植物为原料。

植物的根、茎、叶作为营养器官，具有可运输水和营养物质的天然通道（直径范围大，可满足生物材料的多种孔隙需求），而原有的薄壁细胞等细胞排列整齐。上述天然结构在去除细胞内含物后可通过遗留的细胞壁而维持，利于用作支架，辅助整块细胞培育肉生产。细胞壁中的主要化学成分为天然纤维素，具有亲水性、耐久性、生物相容性和可食用性。

对于植物原料，根、茎、叶、果实均已被研究用于制备去细胞化生物材料。其中，蔬菜、水果的茎、叶、果实在已有研究中更为常见。去细胞化可保留导管、维管束等特定组织的结构，这些结构将利于被接种细胞的附着、排列、迁移、分化，以及营养物质交换，因此该方法目前成为生物医学工程的热点话题（如替代器官），并且已在细胞培育肉领域用于制备支架。Allan等对观赏草进行去细胞化并用C2C12细胞测试细胞生长效果，发现观赏草的天然沟槽结构使其具有优越的诱导细胞定向能力（与草叶沟槽夹角＜10°的细胞占50%，夹角＜20°的细胞占70%）。Jones等用富含维管网络的去细胞化菠菜叶培养初级牛卫星细胞，发现该支架上的细胞可以较长时间（14 d）保持高细胞活性（99%）。对于植物去细胞化常用植物种类与部位、方法与试剂等内容细节，可参考已有综述，此处不再赘述。

去细胞化用于生物医学材料的优点包括：1）与体内ECM高度近似，具有良好的细胞相容性；2）该过程脱除细胞核、细胞质等细胞器，从而去除大多数免疫活性成分、DNA等物质，因此具有低排异性或副作用。

去细胞化用于细胞培育肉支架材料的优点则在于以下4 个方面：1）去细胞化可充分利用植物去除原有细胞后留下的天然3D多孔结构，有效简化支架制备过程，并且可为目标细胞提供尺寸合适的生长空间和真实的细胞外环境；进一步地，去细胞化有助于构建一些常规手段难以获得的精密、复杂的微观支架结构，如导管、维管束等，这些定向结构可以诱导细胞定向排列并实现营养物质输送，利于整块细胞培育肉组织形成。2）若采用常见蔬果的茎、叶、果实进行去细胞化，则原料来源广泛、绿色天然、可再生、成本相对低廉、可食用，并可实现部分农林废弃物的高值化利用。3）一些去细胞化试剂（如乙醇、乙酸、氯化钠、次氯酸钠）和去细胞化方法（如物理低温冻融，或化学浸渍）成本低，并且易获得、易实现，这有助于规模化生产。4）一些去细胞化植物支架可以实现约95%及以上的高细胞活性。

但是同时，去细胞化用于细胞培育肉主要存在如下缺点或问题：1）目前主流的洗涤剂去细胞化方法所需处理时间较长，不利于商品化，如十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）处理的菠菜叶从预处理到冻干结束，累计需要超过10 d。2）去细胞化支架的可食用性存疑。虽然目前研究中的原料优选可食用的蔬果（如苹果、菠菜、芹菜、葱等），但是使用化学试剂法去细胞化会存在不可食用物质残留的风险（如表面活性剂SDS），因此应关注化学试剂残留量并与有关食品标准进行比对。一些学者提到了有毒有害试剂的安全替代品（如用聚山梨酯60替代Triton X-100），但相关替代品的去细胞化效果有待进一步证实。同时，一些化学试剂处理可能在支架中进而在细胞培育肉产品中引入异味（如次氯酸钠、乙酸）。此外，支架的营养评定与感官评价需要被进一步研究。3）同一种类原料的不同个体、同一个体的不同位置均会不可避免地存在变异性，造成不同批次支架差异，不利于商品标准化。4）对于表现出良好细胞活性的去细胞化植物支架，其成功因素主要被归结于良好的孔隙结构或定向微图案，不具备这些物理优势的去细胞化植物支架的表现并不令人满意。虽然后者可能仍与非结构的物理特性有关（如表面亲水性、弹性模量），但这似乎也再次印证了支架主要化学成分天然纤维素本身在细胞黏附性方面的不足。

2.5 定制化结构获取——3D打印

3D打印也被称为增材制造、快速成型，是从计算机辅助设计中获取信息并在3D打印机上建立连续的材料层从而创建固体物体的技术。3D打印技术可分为7 种，其中食品领域较为接受的是热熔/室温挤出、选择性激光烧结/热空气烧结、黏结剂喷射、喷墨打印4 种。3D打印可减少原料损耗，并且可通过同一套设备制造具有多种复杂结构的产品，这一“可自由定制”特性对用于细胞培育肉领域的生物材料目前所处的初期发展阶段而言尤为重要，可帮助研究人员广泛尝试并筛选出适合的生物材料构造。在生物医学工程中，3D打印的应用不断扩展，小到药物递送系统、微血管，大到人工器官乃至解剖模型（以辅助外科手术）。

如图4所示，Erkoc等有研究者采用明胶-纤维素-海藻酸盐复合配制生物墨水以兼顾墨水流变性、挤出成型后材料的力学性能、细胞相容性，然后通过挤出式3D打印制得多层三维填充的和空心的圆柱结构、锥形结构、带有圆柱形和方形孔的网格结构、解剖学仿人工耳4 种结构的水凝胶。

图4 挤出式3D打印获得的不同结构的明胶-纤维素-海藻酸盐水凝胶[77]Fig. 4 Gelatin-cellulose-alginate hydrogels with different structures obtained by extrusion-based 3D printing[77]

如图5所示，Mohan等仅选用纤维素及其衍生物（CMC、CNF）为原料，以水为溶剂制成墨水，利用3D打印、冷冻干燥和脱水热处理方法制得物理交联的、具有200～800 μm可调大孔网格结构的支架。

图5 孔径可调控的3D打印CMC-CNF支架[78]Fig. 5 3D printed CMC-CNF scaffolds with adjustable pore size[78]

3 纤维素在细胞培育肉支架中的挑战与潜在解决方案

3.1 细胞黏附性

天然纤维素表面的非特异蛋白吸附量低（即不含有RGD等细胞锚点），不利于哺乳动物细胞黏附。这是纤维素作为细胞培育肉支架原料的最大挑战。

引入RGD三肽（Arg-Gly-Asp）可增强纤维素的细胞黏附性。RGD是在ECM中发现的具有生物活性的细胞黏附序列，可以与细胞表面的整合素（介导细胞与ECM或与其他细胞的识别和黏附）特异性结合。因此，可以在纤维素表面修饰RGD肽或者含RGD的蛋白，如纤连蛋白、层黏连蛋白、玻连蛋白、胶原或明胶等。然而，RGD与纤维素等非蛋白物质的吸附作用有限，为此可引入纤维素结合模块（cellulose-binding module，CBM）（CBM既有对纤维素表面的高亲和性与特异性，又有对几乎任何生物活性蛋白的结合能力）作为桥梁，从而实现纤维素-RGD的牢固连接。

表面电荷改性可增强纤维素的细胞黏附性。一种方式是化学官能团改性，如阳离子化（如引入季铵基团）和强阴离子化（如引入-SO）。商业化支架中已有化学改性调节纤维素表面电荷的实例，如Cytopore微载体的主要成分是带正电荷的二乙氨基乙基（diethylaminoethyl，DEAE）纤维素，而GrowDex-T水凝胶则是带负电纤维素，二者细胞黏附性均获得提升。采用该方法时需要注意，修饰的官能团是否会损害纤维素可食用性。如季铵盐虽然是提供阳离子、提升纤维素细胞黏附性的代表性物质，但是季铵盐通常不可食用，对应改性纤维素不在批准的食品添加剂范围内；而羧甲基基团修饰的纤维素则可食用，且细胞黏附性获得提升。除化学官能团修饰外，另一种方式是将纤维素与其他阳离子物质复合以改变表面电荷，如天然阳离子多糖——甲壳素或壳聚糖。这种复合可以是物理共混也可以是化学交联，并且可以在纤维素获取时（如加入BC培养体系）、纤维素原料预处理时（如与已获取的纤维素共混制备支架）、纤维素支架制备后（如将支架浸泡）等多个环节之一进行。

3.2 原料成本降低与规模化生产

对于细胞培育肉行业，组织工程等领域的研究已经为其提供了坚实的技术基础，因此目前更为迫切的问题是如何降低成本、扩大规模。纤维素作为细胞培育肉支架的潜在材料，同样需要思考这一问题。纤维素原料的成本可大致分为前期的生产成本和后期的纯化成本。

对于植物纤维素，其资源丰富、广泛、易得，商业化植物纤维素来源主要为木材、棉花，因此前端生产成本低廉。棉花中纤维素含量高达90%，但是木材中纤维素占比约40%～47%，纤维素所在的细胞壁中还含有半纤维素、木质素、果胶等成分，因此需要进行一系列提取纯化操作以达到可食用支架所需原料的高纯度和均一的特定纤维形态。目前，植物纤维素已形成成熟、低廉的提纯工艺（主要为酸水解、机械处理两种）。据有关研究显示，植物纳米纤维素（CNF、CNC）在世界范围内已实现大规模生产且产量仍不断扩大，代表性企业的纳米纤维素产量从20 kg/d（荷兰SAPPI公司）到5 000 kg/d（加拿大Kruger公司）不等，预计纳米纤维素全球产量为33×10t/年。但是为避免纤维素出现不可逆聚集或角质化，需要将纤维素保存在水溶液中，这一方面增加了运输成本，另一方面容易导致微生物污染，增加损耗成本。对此，可先将纤维素失水干燥，运抵后进行再分散。在烘箱干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、超临界干燥方法中，冷冻干燥与超临界干燥可以较好地避免团聚，实现再分散，但是冷冻干燥的成本更可接受。

对于BC，其纤维素纯度远高于植物纤维素，这大幅降低了提纯工艺的繁琐程度。但是上游的BC生产工艺（即传统的微生物静态发酵工艺）存在生产状态不连续、单批次生产时间长、占用空间大、需要的劳动力多、产率低等问题，导致BC综合成本高（是植物纤维素的80 倍）。对此，可从菌株、培养基、培养条件、生物反应器方面着手。菌株方面，可进行自然突变株筛选以获得BC高产菌株，同时，基因修饰获得高产菌株或许是可以接受的，因为转基因成分理论上不存在于BC中，并且BC经历的纯化过程（如1 mol/L NaOH煮沸1 h）会去除携带转基因的细菌。培养基方面，合成培养基是造成BC生产成本高昂的一大主要因素。可开发废弃物作为培养基成分（主要是碳源），如生物柴油生产和葡萄渣中剩余的甘油、无法食用的腐烂香蕉、酒糟水、干酪乳清、甜菜糖蜜等。与人工合成的典型HS（Hestrin and Schramm）培养基相比，上述培养基可降低成本，甚至可以增加产量。培养条件方面，可寻找能耗更低的培养条件，如进行菌株驯化使其可耐10～20 ℃低温（一般菌株适宜温度约为25～30 ℃），以满足寒冷地区的BC培养。生物反应器方面，生物反应器为BC高效、规模化、连续化生产提供条件，为此可设计并优化生物反应器，包括相对静态条件下的反应器如盘式反应器、气溶胶反应器、膜反应器等，以及动态条件下的反应器如球形鼓泡塔式反应器、气升式反应器等。

3.3 材料加工性能

天然纤维素“不熔”，且“不溶”的特点使其在加工方面存在挑战。具体来说，一方面，天然纤维素无法熔化，高温下直接分解；另一方面，天然纤维素溶解性低，不溶于常见的水和有机溶剂，可溶于氯化锂/,-二甲基乙酰胺（lithium chloride/,-dimethylacetamide，LiCl/DMAc）、-甲基吗啉--氧化物（-methylmorpholine--oxide，NMMO）、NaOH/尿素水溶液等溶剂体系，但是这些溶剂不可食用甚至有毒有害，难以应用于细胞培育肉支架。对于纤维素溶解的原理存在两种主流观点，一是溶剂破坏了分子内和分子间的氢键网络。与之相反，另一种观点则认为，纤维素具有两亲性，溶剂消除了强烈影响溶解的纤维素分子间疏水相互作用。

对于天然纤维素难加工的问题，可以对纤维素进行化学改性以增强水溶性。降低DP或分子质量也有助于纤维素溶解。此外，可以选择适用于纤维素分散液（而不是只适用于溶液）的加工方式，从而避免不可食用溶剂的引入。

3.4 力学性能

支架各项力学性能中受重点关注的是刚度，其常用评价指标为弹性模量（尤其是杨氏模量）。肌肉和脂肪细胞均对基质刚度敏感，但是不同类型的细胞对刚度有不同要求。以肌肉细胞为例，虽然在不同刚度的基质上均可形成肌管，但是所得肌管长度和肌管簇数量存在差异，并且仅在近似天然骨骼肌的刚度（杨氏模量约12 kPa）上出现含肌球蛋白或肌动蛋白条纹的肌管。基于细胞-刚度响应这一因素，Bomkamp等提出，对于肌源性细胞和脂肪源性细胞，支架的理想杨氏模量分别约为12～21 kPa和2～3 kPa。除细胞增殖与分化的角度外，从食品口感的角度考量，细胞培育肉支架在烹饪后应具有适中的刚度以保证良好咀嚼性已达到对肉品的逼真模仿，尽管目前对热处理支架力学性能的研究极其有限。

纤维素本身刚度大。对于植物纤维素，MCC的杨氏模量约为25 GPa。受各向异性、纤维素中的晶体缺陷、结晶度、尺寸、测量方法等因素影响，CNC的杨氏模量数值不等（7.5～143.0 GPa）。BC单根纤维的杨氏模量约为80 GPa，由双向和单向拉伸测试得到的BC膜的杨氏模量则分别为200～500 MPa和1～10 MPa。虽然纤维素材料本身的刚度大，但是纤维素支架成品的刚度受纤维素原料特性、制备方法等众多因素影响而呈现出宽阔的可变范围。总体而言，支架的刚度由材料刚度、结构刚度二者从不同维度共同决定。因此，相关研究人员可从这两方面入手调整纤维素支架整体的刚度。

调节纤维素材料刚度的方式包括与其他材料复合、物理或化学交联等。比如，用海藻酸盐（1 g/100 mL）和CNF（0.15～0.75 g/100 mL）为原料、CaCO和-葡萄糖酸--内酯为交联剂可制备杨氏模量约为5～60 kPa的水凝胶。这一刚度范围适合肌源细胞生长，并且上述原料均可食用。再如，胶原功能化（杨氏模量（2.2±0.2）kPa）、戊二醛化学交联（杨氏模量（4.1±0.3）kPa）均可增加去细胞化苹果组织（（1.1±0.1）kPa）的刚度。但是来自动物的胶原和有毒的戊二醛不适于构建细胞培育肉支架，因此在复合材料、交联材料的选择上应慎重考量。不影响食用性的常用纤维素-纤维素交联材料主要为柠檬酸。对于纤维素-复合材料交联，交联剂是否使用及选用种类视二者物理化学特性而定。比如利用蛋白和碳水化合物混合后在高温下发生的美拉德反应，可实现纤维素与大豆蛋白等非动物源蛋白的交联。此外，纤维素结晶度与材料刚度呈正相关，因此可选用适宜结晶度的纤维素制备支架。

减小结构刚度的方式包括前文中提到的造孔、构建定向孔道等。随着孔隙度增加，支架中起力学支撑的实质减少，整体结构更为松散，刚度降低。Isobe等通过调节纤维素浓度，制备出杨氏模量30 kPa～1.3 MPa的纤维素水凝胶。而在通过盐析法引入直径约为300 μm的孔隙后，材料的杨氏模量降低至5.4 kPa。

此外，为满足理想的支架刚度，去细胞化植物支架似乎是最简便的选择。植物支架在去细胞化处理后杨氏模量普遍下降，多数未改性去细胞化植物支架的杨氏模量在1 kPa（苹果萼筒组织）～21 kPa（菠菜叶）范围内，这与期待的细胞培育肉支架刚度相接近，省去大量额外操作。当然，这一合适的模量区间也得益于研究者倾向于选择较为柔软的植物样品，比如禾本科植物的叶片。实际上，在植物种类、来源部位、处理方式等多种因素影响下，去细胞化植物的刚度可以实现杨氏模量从千帕级到吉帕级的大范围波动。

4 结 语

本文讨论了纤维素在细胞培育肉支架中的应用潜力与挑战。细胞培育肉领域迫切寻求非动物源、可食用、成本低廉的支架原料。细胞培养常用的可食用支架材料包括胶原或明胶、壳聚糖、透明质酸、大豆蛋白、海藻酸钠、琼脂糖、纤维素等。在限定非动物来源的情况下，纤维素具有明显的成本优势。纤维素主要存在于植物细胞壁，是自然界中含量最丰富的高分子，作为膳食纤维有助人体健康。此外，纤维素已在医学、生物领域具有研究基础和商业化生产基础。因此，纤维素有望成为优质支架原料，推动细胞培育肉产业发展。

本文介绍了适用于纤维素基细胞培育肉支架的制备方法。多孔结构可通过冷冻干燥、发泡、牺牲材料、盐析等方式形成。分化用支架所需的定向结构可通过定向冷冻、机械拉伸等实现。微载体所需的微球结构更适合由微生物原位生成球形BC而获得。因此，如需获得具有两种及以上上述结构的支架，可同时采取多种方式。如希望仅用一种方法获得上述多种特定结构的支架，则可通过去细胞化法获得天然精细结构，或者通过3D打印获得可定制化的复杂结构。

然而，纤维素在细胞培育肉支架中存在一定挑战。对于细胞黏附性有限的问题，可以引入RGD肽和含RGD的蛋白，更经济的方法是进行表面电荷改性。对于不易溶解导致加工困难的问题，可使用水溶性良好的纤维素衍生物，此外也可采用非溶解状态纤维素制备支架，以规避有毒溶剂问题。对于纤维素刚度与细胞培育肉理想支架差异较大的问题，可以通过调控支架结构、交联、与其他材料复合、选择合适结晶度的纤维素等方式调节刚度，不过更直接可行的方法是以去细胞化植物为支架。

整体而言，虽然植物纤维素支架的工艺更成熟，但BC和去细胞化纤维素分别以其原位调控成形的灵活性和简单操作即可获得的精细结构而在细胞培育肉支架中同样具有良好前景。纤维素基生物材料的设计与优化有待相关科研人员进一步探索研究，从而助力细胞培育肉生产。