何雪梅，岳 健，邱福荣，唐雅园，苏 娟，赵艳娟，管世超，孙 健,*

（1.广西壮族自治区农业科学院农产品加工研究所，广西 南宁 530007；2.广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室，广西 南宁 530007；3.云南山里红生物科技有限公司，云南 昆明 650200）

滇黄精（Coll. et Hemsl.）系百合科滇黄精属植物，又名鸡头滇黄精、老虎姜、黄鸡菜、鸡爪参等，其根茎是我国传统的药食两用材料，具有滋肾润肺、补脾益气的功效。多糖是滇黄精中的主要功效成分之一，现代药理学研究表明滇黄精多糖具有降血糖、降血脂、提高免疫力、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等功效，可广泛应用于药品、保健品、食品和化妆品中，具有广阔的应用前景。热水浸提法、酸碱提取法、酶解提取法是传统的滇黄精多糖提取技术，具有提取方法简单的优点和提取率低的缺点。随着技术的进步，研究发现提取前的破壁处理可提高多糖得率，因此在传统提取技术的基础上，新型提取技术如超声波辅助提取、微波辅助提取、闪式提取、高压辅助提取等及复合提取技术得到发展。破壁前处理辅助新型提取技术在提取效率、得率和提高滇黄精多糖活性方面表现出良好的应用潜力。

动态超高压微射流（dynamic high-pressure microfluidization，DHPM）技术是一种新兴的功能成分提取技术，目前已应用于多糖提取与改性，该技术通过瞬时强烈剪切、高速碰撞、瞬间压力释放等作用促进细胞壁破裂，提高多糖提取率；同时通过剪切作用打断多糖的分子链，改变分子的聚集状态，造成多糖结构的变化，从而影响其理化性质和生物活性。综上所述，DHPM是一种多糖提取的有效新技术，但目前鲜见利用DHPM提取滇黄精多糖的研究报道。

本实验运用DHPM辅助提取滇黄精多糖，优化其提取工艺条件，并分析其对滇黄精多糖结构、理化性质及生物活性的影响，为滇黄精多糖的开发利用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

滇黄精（Coll. et Hemsl.）2020年1月采自云南普洱，清洗后切片，于50 ℃低温烘干，粉碎过60 目筛备用。

-葡萄糖苷酶（总酶活力100 U、总质量9.19 mg）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、酪氨酸酶（总酶活力1 000 U、总质量1 mg）、葡聚糖标准品和单糖标准品 美国Sigma公司；阿卡波糖 北京拜耳医药保健有限公司；熊果苷 广州珠峰进出口贸易有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）、对硝基苯---葡萄糖苷（-nitrophenyl---glucopyranoside，PNPG） 北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖、浓硫酸、乙醇等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

M-110EH型微射流均质机 美国Microfluidics公司；GYB40-10S小型均质机 上海东华高压均质机厂；FT-IR650傅里叶变换红外光谱仪 天津港东科技发展股份有限公司；1260高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；HAAKE Mars-III旋转流变仪 美国赛默飞世尔公司；101-3电热鼓风恒温干燥箱 上海浦东荣丰科学仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；752N紫外-可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；SHZ-82水浴恒温振荡器 金坛市恒丰仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 滇黄精粗多糖的提取

1.3.1.1 热水浸提法提取滇黄精多糖

称取50 g滇黄精样品，加入1 500 mL去离子水，于100 ℃下浸提2 h，滤布过滤后收集上清液，55 ℃减压浓缩至300 mL，加入4 倍体积的95%（体积分数，下同）乙醇溶液，4 ℃冰箱内醇沉过夜，5 000 r/min离心15 min后，收集沉淀即为热水浸提滇黄精粗多糖，记为WPKP。

1.3.1.2 DHPM辅助提取滇黄精多糖

参考秦令祥等的方法并作适当修改，精确称取50 g滇黄精分散于1 500 mL去离子水中，先采用小型均质机均质5 min（压力为30 MPa），再经过微射流均质机处理（100、120、140、160、180 MPa）2 次后热水浸提1 h，滤布过滤后收集上清液，55 ℃减压浓缩至300 mL，加入4 倍体积的95%乙醇溶液，4 ℃下醇沉过夜，5 000 r/min离心15 min后，取沉淀冷冻干燥，得到不同均质压力DHPM辅助提取滇黄精多糖，分别记为DPKP-100、DPKP-120、DPKP-140、DPKP-160、DPKP-180。

1.3.2 滇黄精多糖得率和基本成分测定

1.3.2.1 滇黄精多糖得率的测定

滇黄精中多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，多糖得率按照公式（1）计算。

1.3.2.2 滇黄精多糖纯化组分水分、灰分、蛋白质量分数的测定

滇黄精多糖纯化组分水分质量分数测定参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》；灰分质量分数测定参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》；蛋白质量分数测定参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》。

1.3.3 滇黄精多糖的分离纯化

以得率为评价指标，根据1.3.1.2节优化的提取压力（140 MPa）制备WPKP、DPKP，用去离子水配制成100 mg/mL的粗多糖液，经Sevag法除蛋白，对脱蛋白的多糖溶液浓缩后进行DEAE-52柱层析，依次用去离子水和0.l、0.2、0.3、0.4 mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱液由自动收集器收集，控制流速为1.0 mL/min，每7 min收集1 管。多糖含量利用苯酚-硫酸法进行追踪检测，根据490 nm波长处OD值峰形收集洗脱液，所收集洗脱液浓缩后经3 500 Da透析袋透析，透析所得样品冷冻干燥。

1.3.4 滇黄精多糖分子质量的测定

滇黄精多糖分子质量采用高效凝胶色谱（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法测定。将纯化后的滇黄精多糖样品用去离子水配制成2.0 mg/mL的溶液，过0.22 μm膜备用。HPGPC的测定条件：色谱柱为PL aquagel-OH Mixed（300 mm×7.5 mm，8 μm）；检测器为2414示差折光检测器；流动相为超纯水；流速为0.6 mL/min；柱温为35 ℃；进样量为50 μL。以不同分子质量的葡聚糖溶液为标准品作标准曲线，多糖的分子质量（平均分子质量、重均分子质量和数均分子质量）由标准曲线方程计算得出。

1.3.5 滇黄精多糖黏度的测定

纯化后的滇黄精多糖用去离子水配制成2 mg/mL的多糖溶液。采用旋转流变仪测定多糖黏度，测定条件如下：样品台温度为37 ℃；C60号转子；剪切速率为30.0 s；每秒读数1 次；测定时间为60 s。测定进行3 次平行，取平均值。

1.3.6 滇黄精多糖的红外光谱分析

称取1.3.3节2 种纯化后的滇黄精多糖样品（各2 mg），与200 mg溴化钾混匀压制成片，空白对照采用溴化钾粉末压片制成（去除溴化钾在红外光谱下的吸收）。分别置于傅里叶变换红外光谱仪，在500～4 000 cm波数范围内扫描。

1.3.7 滇黄精多糖的单糖组成测定

采用PMP柱前衍生-高效液相色谱法测定不同方法提取滇黄精多糖的单糖组成。取纯化后的滇黄精多糖样品10 mg加入至2 mL 2 mol/L的三氟乙酸溶液中，130 ℃水解2 h，即得多糖的水解液。样品水解液、单糖标准品溶液、混合标准品溶液经PMP衍生后，过0.22 μm膜进行色谱分析。

高效液相色谱条件为：色谱柱：EC-C分离柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；检测器及波长：250 nm紫外检测器；流动相：流动相A为（乙腈）∶（pH 6.9 20 mmol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS））＝15∶85，流动相B为（乙腈）∶（pH 6.9 20 mmol/L PBS）＝40∶60；梯度洗脱条件：0～12 min 90% B，12～20 min 75% B，20～22 min 90% B；进样量：10 μL；流速：0.5 mL/min。

1.3.8 滇黄精多糖1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力测定

采用体外DPPH自由基清除能力评价多糖的抗氧化能力，2 mL 0.2 mmol/L的DPPH工作液与2 mL不同质量浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）滇黄精多糖溶液充分混匀，避光反应30 min，于517 nm波长处测定反应体系吸光度。以VC为阳性对照，按照公式（2）计算样品的DPPH自由基清除率。

式中：为2 mL样品溶液+2 mL DPPH工作液的吸光度；为2 mL样品溶液+2 mL无水乙醇的吸光度；为2 mL DPPH工作液+2 mL无水乙醇的吸光度。

1.3.9 滇黄精多糖降血糖活性测定

以-葡萄糖苷酶抑制活性表征降血糖活性。葡萄糖苷酶抑制能力测定参照施吉祥等的方法并作适当修改，反应体系为：0.05 mL 8 U/mL-葡萄糖苷酶、2 mL 0.05 mol/L的磷酸钠缓冲溶液（pH 6.8）和0.1 mL不同质量浓度（1、2、3、4、5、6、7、8 mg/mL）多糖样品溶液，混匀后于37 ℃下水浴10 min，加入0.05 mL 8 mmol/L PNPG溶液，混匀后于37 ℃恒温处理10 min，最后加入2 mL 0.1 mol/L NaCO溶液终止反应，于405 nm波长处测定吸光度，以蒸馏水调零，重复3 次，取平均值。阳性对照为阿卡波糖，按照公式（3）计算样品的-葡萄糖苷酶活性抑制率。

式中：为不加待测样品反应后的吸光度；为加入待测样品反应后的吸光度；为待测样品的吸光度。

1.3.10 滇黄精多糖酪氨酸酶活性抑制率测定

参考Huang Lixin等方法并修改。50 μL不同质量浓度滇黄精多糖溶液中分别加入50 μL 100 U/mL酪氨酸酶溶液、90 μL PBS（pH 6.8），混匀后于37 ℃下孵育5 min，然后加入60 μL 2.5 mmol/L的-酪氨酸溶液，37 ℃下反应10 min，于490 nm波长处测定吸光。阳性对照为熊果苷，样品对酪氨酸酶活性的抑制率按照公式（4）计算。

式中：为样品组反应体系吸光度；为样品背景组（PBS代替酪氨酸酶溶液）反应体系吸光度；为空白组（蒸馏水代替样品）反应体系吸光度；为空白背景组（蒸馏水代替样品、PBS代替酪氨酸酶溶液）反应体系吸光度。

1.4 数据统计与分析

采用Origin 8.5软件分析数据及作图，数据以平均值±标准误差表示，采用单因素方差分析法进行差异显著性分析，以＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 DHPM对滇黄精多糖提取得率的影响

比较DHPM辅助提取与热水浸提对滇黄精粗多糖提取得率的影响，结果如图1所示。DHPM压力对多糖提取得率有显著影响，随着压力的增大，多糖得率总体显著提高。140 MPa压力下提取所得多糖得率最高，达18.21%，是WPKP多糖得率（11.14%）的1.63 倍。DHPM技术通过强烈剪切和高速撞击等作用使滇黄精颗粒在水中分散得更均匀，同时加速滇黄精细胞壁的破碎，使细胞的通透性增大，溶剂更易进入细胞内部，有利于提高滇黄精多糖的得率；瞬时压力作用促进了传质过程，溶剂可在极短的时间内渗透细胞壁，使多糖快速溶出，进而提高提取效率。增大微射流压力提高了多糖得率，是由于高压下细胞破碎程度高有利于多糖溶出，当压力超过140 MPa后，滇黄精颗粒已充分破碎，并不会进一步促进多糖溶出，继续增大微射流压力（160 MPa和180 MPa）导致体系黏度增大，过滤不完全，造成多糖得率测定误差增大，且得率稍有降低。综上，DHPM辅助提取滇黄精多糖得率显著高于热水浸提，提取压力以140 MPa为宜，后续利用140 MPa提取样品进行实验。

图1 不同提取方法所得滇黄精粗多糖得率Fig. 1 Yield of crude Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.polysaccharides obtained by different extraction methods

2.2 DEAE-52 Cellulose柱层析对滇黄精多糖的纯化

图2为140 MPa下制备的WPKP和DPKP经DEAE-52柱层析得到的洗脱曲线。由图2可知，以去离子水和不同浓度（0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L）的NaCl溶液进行洗脱，2 种多糖均呈现1 个主洗脱峰。DPKP的主洗脱峰出现在24～34 管，由0.1 mol/L NaCl溶液洗脱而得，命名为DPKP-1；WPKP的主洗脱峰出现在30～38 管，由0.1 mol/L NaCl溶液洗脱而得，命名为WPKP-1。收集DPKP-1和WPKP-1洗脱液进行浓缩、透析和冷冻干燥。对DPKP-1和WPKP-1样品进行成分测定，结果如表1所示，DPKP-1和WPKP-1的多糖质量分数分别高达75.95%和69.86%，纯度较高，其他成分质量分数较低，说明DEAE-52对滇黄精多糖的纯化非常有效。

图2 WPKP和DPKP的洗脱曲线Fig. 2 Elution curves of WPKP and DPKP

表1 纯化后不同提取方法所得滇黄精多糖的成分质量分数Table 1 Composition of Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.polysaccharides obtained by different extraction methods

2.3 DHPM对滇黄精多糖相对分子质量和黏度的影响

DHPM辅助提取和热水提取得到的滇黄精多糖DPKP-1和WPKP-1经洗脱均得到1 个主峰，经HPGPC法测定，2 种多糖的分子质量如表2所示，DPKP-1的分子质量较WPKP-1的分子质量降低了27.90%，说明DHPM处理降低了多糖的分子质量。此外，比较了2 种多糖的聚合物分散性指数（polymer dispersity index，PDI）（重均分子质量/数均分子质量），该指标反映了多糖分子质量的分布宽度，PDI越大表示分子质量分布范围越广，PDI越小表示分子质量分布越窄、越集中。DPKP-1的PDI是WPKP-1的2.34 倍，说明DPKP-1分子质量分布广、大小不均一。上述结果表明，DHPM通过强烈的机械剪切作用打断多糖长分子链，切断多糖糖苷键，有效地降解糖链，使提取到的多糖分子质量显著降低，造成分子质量大小不均一。多糖的分子质量与其生物活性有密切联系，经各种方法降解获得的低分子质量多糖可显著提高抗氧化性，故推测用DHPM辅助提取的多糖可能具有更高的抗氧化活性。

表2 不同提取方法所得滇黄精多糖的平均分子质量与黏度Table 2 Average molecular mass and apparent viscosity of Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl. polysaccharides obtained by different extraction methods

DPKP-1分子质量的降低也导致了其黏度的降低，DPKP-1的黏度较WPKP-1的黏度降低了29.04%。研究表明，黏度与生物活性有关联，高黏度常限制了多糖的应用。DHPM可显著降低多糖的黏度，从而拓展滇黄精多糖利用的可能性。

2.4 DHPM对滇黄精多糖傅里叶变换红外光谱的影响

红外光谱因灵敏度高、分辨率高等优点常用于分析分子结构和化学键，是研究多糖结构的重要方法之一。图3为DPKP-1和WPKP-1的傅里叶变换红外光谱图，两者的红外光谱非常相似，都具有糖类化合物的特征吸收峰。3 600～3 200 cm的宽峰是—OH的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。3 376 .75 cm（DPKP-1）和3 378.35 cm（WPKP-1）处的宽吸收峰是糖分子O—H的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰。在2 927.41 cm（DPKP-1）和2 925.74 cm（WPKP-1）处的吸收峰归因于C—H伸缩振动（CH、CH、CH）。在1 644.98 cm（DPKP-1）和1 645.25 cm（WPKP-1）处的较强吸收峰可能归因于多糖中—OH的弯曲振动。在1 421.28、1 132.01 cm（DPKP-1）和1 420.13、1 134.57cm（WPKP-1）处的吸收峰归因于C—O伸缩振动。在1 328.71、1 261.22 cm（DPKP-1）和1 328.96、1 263.77cm（WPKP-1）处的吸收峰归因于O—H变角振动。在929.25 cm（DPKP-1）和930.68 cm（WPKP-1）处的吸收峰归因于吡喃环的非对称环伸缩振动，说明两种多糖均含吡喃环。综上可知，DPKP-1和WPKP-1的红外光谱相似，说明DHPM辅助提取未对滇黄精多糖的主要结构造成影响，这与寇玉的研究结果相似。

图3 DPKP-1和WPKP-1的傅里叶变换红外光谱Fig. 3 Fourier transform infrared spectra of DPKP-1 and WPKP-1

2.5 DHPM对滇黄精多糖单糖组成的影响

图4为DPKP-1和WPKP-1的单糖组成高效液相色谱图，可见2 种多糖均为中性多糖，主要由9 种单糖组成，9 种单糖的出峰顺序相同，但每种单糖的含量不同。2 种多糖的单糖组成如表2所示，DPKP-1以甘露糖、半乳糖、葡萄糖为主，总物质的量百分比为83.23%，WPKP-1以甘露糖、氨基半乳糖、半乳糖和葡萄糖为主，总物质的量百分比为81.21%。2 种多糖中木糖、岩藻糖的含量均很少。DHPM辅助提取提高了滇黄精多糖中甘露糖的含量，为热水提取滇黄精多糖的2.11 倍，降低了半乳糖和氨基半乳糖含量，分别约是热水提取的57%和18%。由此可见，DHPM处理改变了多糖的结构，可能会导致多糖活性的差异。

图4 DPKP-1和WPKP-1单糖组成的HPLC图Fig. 4 HPLC profiles of monosaccharide composition of DPKP-1 and WPKP-1

表2 不同提取方法所得滇黄精多糖的单糖组成Table 2 Monosaccharide composition of Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl. polysaccharides obtained by different extraction methods

2.6 DHPM对滇黄精多糖DPPH自由基清除能力的影响

DPKP-1和WPKP-1对DPPH自由基的清除能力如图5所示，2 种滇黄精多糖均有一定的DPPH自由基清除能力，但清除能力远低于VC。DPKP-1的DPPH自由基清除能力明显优于WPKP-1。多糖结构、连接方式、分子质量以及多糖的化学组成等因素均可影响多糖抗氧化活性，以往的研究认为分子质量较小的多糖具有较高的抗氧化活性。本实验中抗氧化活性分析结果与分子质量分析结果相互印证，也与以往的文献报道相符。高压处理可降低石斛多糖的分子质量并提高其体内外抗氧化活性；DHPM处理可改变木霉多糖形态、提高其抗氧化活性；DHPM处理未改变杜仲雄花多糖结构，但降低了其分子质量，提高了其抗氧化能力。综上可知，DHPM辅助法可能通过降低滇黄精多糖分子质量、改变其单糖组成，从而提高滇黄精多糖的抗氧化活性。

图5 DPKP-1和WPKP-1的DPPH自由基清除能力Fig. 5 DPPH radical scavenging capacity of DPKP-1 and WPKP-1

2.7 DHPM对滇黄精多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的影响

-葡萄糖苷酶活性是糖尿病控制和治疗过程中的重要监测指标。图6显示了DHPM辅助提取与热水提取滇黄精多糖的-葡萄糖苷酶抑制活性，DPKP-1、WPKP-1具有较强的-葡萄糖苷酶抑制活性，且两者与-葡萄糖苷酶抑制活性呈量效关系。经计算，DPKP-1对-葡萄糖苷酶的半抑制质量浓度（half maximal inhibitory concentration，IC）为4.07 mg/mL，WPKP-1对-葡萄糖苷酶的IC为5.83 mg/mL，说明DHPM对滇黄精多糖的-葡萄糖苷酶抑制活性有提升作用。多糖中单糖所包含的不同羟基基团也是影响多糖-葡萄糖苷酶抑制活性的重要因素，多糖单糖组成分析结果显示DPKP-1与WPKP-1的单糖组成有较大差异，这也可能是造成DPKP-1的-葡萄糖苷酶抑制活性高于WPKP-1的原因之一。DHPM产生的高速冲击力对多糖具有重组作用，糖键断开和基团暴露的变化导致多糖的组分发生了变化。此外，DHPM还能一定程度地拉伸多糖分子，可能引起单糖的组成和分子聚集状态变化，从而改变多糖分子间的空间结构与分子间作用力。

图6 DPKP-1和WPKP-1的α-葡萄糖苷酶活性抑制率Fig. 6 α-Glycosidase activity inhibitory rate of DPKP-1 and WPKP-1

2.8 DHPM对滇黄精多糖抑制酪氨酸酶活性的影响

酪氨酸酶是黑色素生物合成中限速效应的关键酶，是一种活性中心含有Cu的多功能氧化酶，产品的美白功能可由酪氨酸酶活性抑制率来评价。DHPM辅助提取与热水提取滇黄精多糖的酪氨酸酶抑制活性如图7所示，经计算，DPKP-1对酪氨酸酶的IC为2.53 mg/mL，WPKP-1对酪氨酸酶的IC为2.87 mg/mL，但两者均高于熊果苷的IC（0.13 mg/mL），说明DPKP-1、WPKP-1虽具有较强的酪氨酸酶抑制活性，但其抑制活性均低于熊果苷。DPKP-1、WPKP-1与酪氨酸酶抑制活性之间存在一定的量效关系，在0～0.2 mg/mL和4.2～5.0 mg/mL范围内，WPKP-1的酪氨酸酶抑制活性略高于DPKP-1，在0.2～4.2 mg/mL范围内，WPKP-1的酪氨酸酶抑制活性略低于DPKP-1。因此，不论从两者对酪氨酸酶抑制活性的半抑制浓度，还是从两者与酪氨酸酶抑制活性之间的量效关系来分析，DPKP-1与WPKP-1对酪氨酸酶的抑制活性差异不大，表明DHPM对滇黄精多糖抑制酪氨酸酶活性无明显影响，这可能与滇黄精多糖抑制酪氨酸酶活性的作用机理有关。

图7 DPKP-1和WPKP-1的酪氨酸酶活性抑制率Fig. 7 Tyrosinase activity inhibitory rate of DPKP-1 and WPKP-1

3 结 论

本实验通过比较DHPM提取技术和常规热水浸提对所得滇黄精多糖结构和活性的影响，发现相对于常规的热水浸提，DHPM辅助提取技术显著提高了滇黄精多糖的得率，改变了滇黄精多糖的单糖组成，降低了多糖的分子质量和黏度，提高了滇黄精多糖的DPPH自由基清除能力和-糖苷酶抑制活性，但对滇黄精多糖的主要结构和酪氨酸酶抑制活性无显著性变化。综上所述，DHPM辅助提取技术在提高滇黄精多糖得率、增强其抗氧化和降血糖活性方面均有明显的优势，表明DHPM是一种非常具有应用价值和推广前景的滇黄精多糖提取方法。