韩 君

(北京康仁堂药业有限公司，北京 101301)

去氢松香酸(dehydroabietic acid)与松香酸都是松香的主要成分，来源于松柏、云杉、落叶松和冷杉等针叶类植物[1]。去氢松香酸具有抗炎等生物活性，如：通过PPAR-γ和PPAR-α的双重激活减轻高脂肪饮食诱导的胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性[2]；通过激活Keap1/Nrf2-ARE信号通路来减少非酒精性脂肪肝的铁死亡[3，4]。文献鲜有对其在大鼠体内的绝对生物利用度的相关研究。目前，高效液相色谱-质谱联用法因其特异性强、灵敏度高，在血药浓度定量分析领域应用广泛[5-7]。本实验采用液相色谱-质谱联用方法建立测定大鼠血浆中去氢松香酸的方法并运用于大鼠体内药代动力学研究，为后续该化合物的相关研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药品和仪器

去氢松香酸(批号：X28M7B14793，上海源叶生物科技有限公司)；SOLUTOL HS 15(批号：O21GY164716，上海源叶生物科技有限公司)；去氢松香酸标准品(批号：PCS-210816，成都植标化纯生物技术有限公司)；格列本脲(Sigma-Aldrich公司，美国)。液质联用仪(岛津LCMS8030)。

8只SD雄性大鼠购自杭州医学院，许可证号为SCXK(浙)2019-0002。动物饲养环境屏障设施：实验室设施许可证编号SCXK(浙)2018-0016；饲养温度保持在20～26 ℃，确保温度变化不超过4 ℃；湿度控制在40%～70%，避免噪声刺激，将动物房内的噪声控制在60 dB或以下。本实验使用的大鼠和喂养条件符合《实验动物管理办法》的规定。

1.2 色谱和质谱条件

色谱柱为ODSC18柱(100×2.1 mm,3.5 μm)，柱温为40 ℃，流动相(A，CAN；B，0.1%FA水溶液)。流动相梯度：0～0.5 min，60%～5% A；0.5～1 min，5% A；1～2 min，5%～60% A；2～7 min，60% A。流速为0.25 mL/min，进样量10 μL。每个样品检测所需时间为7 min。质谱为电喷雾离子源(ESI)，多级反应检测(MRM)，负离子模式。

1.3 溶液制备

分别精密称取去氢松香酸10 mg，加入甲醇定容至10 mL，配制成质量浓度为1 mg·mL-1的储备液。取去氢松香酸储备液，用甲醇进行梯度稀释，配制成50、100、200、500、800、1 000、5 000和10 000 ng·mL-1的工作液。取格列本脲储备液，用乙腈稀释为质量浓度为200 ng·mL-1的内标工作液。采用去氢松香酸标准品配制浓度为150、750和7 500 ng·mL-1的去氢松香酸标准溶液。

1.4 血浆样本处理

取50 μL血浆，加入150 μL内标工作液，涡旋振荡3 min，14 000 r·min-1离心20 min，取120 μL上清液进行质谱检测分析。

1.5 专属性

按照色谱条件，测定空白大鼠血浆、含内标和去氢松香酸的标准血浆样本、只含内标的空白样本、灌胃去氢松香酸7 min的血浆样品、尾静脉注射去氢松香酸7 min的血浆样品的离子流色谱图。

1.6 线性关系

取空白血浆45 μL，分别加入5 μL去氢松香酸标准溶液，配制成相当于去氢松香酸浓度为50、100、200、500、800、1 000、5 000、10 000 ng·mL-1的基质样本，按1.4方法操作。每个浓度平行处理2份(n=2)，并以权重因子1/X2进行线性回归。

1.7 精密度与回收率试验

取50 μL空白血浆，加入去氢松香酸标准溶液，配制成去氢松香酸浓度为150、750和7 500 ng·mL-1的质控样本(n=6)。并按1.4方法处理后进样分析，连续测定3次，分析结果通过标准曲线拟合计算，用偏差表示准确度，用变异系数表示精密度。

分别取空白血浆以及空白血浆加入乙腈提取后的溶液各50 μL，加入去氢松香酸标准溶液，配制成去氢松香酸浓度为150、750和7 500 ng·mL-1的质控样本(n=6)。通过比较常规质控样品与加入分析物及内标溶液的提取空白样品中分析物及内标的响应值，来计算回收率(用百分比表示)。

1.8 基质效应

取50 μL空白血浆(基质)和超纯水50 μL，分别加入去氢松香酸标准溶液，配制成相当于去氢松香酸浓度为150和750 ng/mL的质控样本(n=6)。用基质存在时的峰面积(A1)与基质不存在时的峰面积(A2)的比值表示分析物和内标的基质因子(MF)，MF=A1/A2。用分析物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子。

1.9 稳定性考察

取50 μL空白血浆，加入格列本脲标准溶液，加入去氢松香酸标准溶液，配制成相当于去氢松香酸浓度为150、750和7 500 ng·mL-1的质控样本(n=6)。分别考察空白血浆室温放置24 h、-80 ℃反复冻融3次，提取后样本室温放置24 h、-80 ℃放置72 h，以及配制的150、750和7 500 ng·mL-1浓度的质控样本室温放置24 h的稳定性。稳定性样本和新鲜配制的样本均按1.4方法处理后进行进样分析。

1.10 药代动力学试验

8只SD大鼠实验前禁食12 h后随机均分为口服给药组和静脉注射组两组。口服给药组通过灌胃给药10 mg·kg-1去氢松香酸，静脉注射组通过尾静脉给药1 mg·kg-1去氢松香酸。口服给药组样品制备方法为称量去氢松香酸适量，加入0.5%羧甲基纤维素钠，超声混悬，配制成相应的混悬液。静脉注射组样品制备方法为称量去氢松香酸适量，加入10%二甲基亚砜、20% SOLUTOL HS 15和70%生理盐水。采血点设计如下：口服给药前及服药后0 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h和24 h时，眼眶后静脉丛采血300～400 μL，血液转移至预先加入EDTA-K2的1.5 mL试管中；静脉注射前及注射后0 min、5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h和24 h时，眼眶采血300～400 μL，血液转移至预先加入EDTA-K2的1.5 mL试管中。全血样品离心10 min(8 000 r·min-1, 4 ℃)，获取血浆100～200 μL，血浆样品立即放入-70 ℃冰箱中冻存。整个样品处理过程在采血后15 min 内完成。

2 结果

2.1 专属性

去氢松香酸保留时间为4.3 min，内标保留时间为3.6 min，空白血浆中内源性物质不干扰药物和内标的测定，内标物不干扰药物的测定，见图1。

图1 专属性试验色谱图：空白大鼠血浆(A)、含内标和去氢松香酸的标准血浆样本(B)、只含内标的空白样本(C)、灌胃去氢松香酸7 min的血浆样品(D)、尾静脉注射去氢松香酸7 min的血浆样品(E)

2.2 标准曲线与定量下限

去氢松香酸回归方程y=6.250 9x+1 230.2，线性范围为50～10 000 ng·mL-1，R2=0.999 6，最低定量下限为30 ng·mL-1。

2.3 精密度与回收率

批内和批间精密度误差均未超过20%，方法总误差(即相对偏差绝对值与变异系数之和)未超过30%，回收率可达90%以上，回收率和相对回收率的变异系数小于15%。

2.4 基质效应

由6批基质计算的内标归一化的基质因子的变异系数均小于15%。

2.5 稳定性

经处理的血浆在室温放置24 h、-80 ℃反复冻融3次、提取后样本室温放置24 h、-80 ℃放置 72 h，以及配置的150、750和7 500 ng·mL-1浓度的质控样本室温放置24 h仍能保持稳定，每份溶液的仪器响应值变异系数在10%之内，并且两份溶液仪器平均响应值的差异在±10%之内。

2.6 药代动力学研究结果

采用建立并经过验证的方法检测大鼠血浆中去氢松香酸的浓度，绘制血药浓度-时间曲线见图2，使用WinNolin 6.1软件分析药代动力学参数见表1。由图2(A)可知，大鼠口服去氢松香酸后，血液中药物浓度逐渐上升，18 min达到最大吸收，即达峰时间Tmax为(0.3±0.0)h，达峰浓度Cmax为(4 996.4±958.1)ng·mL-1。由图2(B)可知，去氢松香酸注射进入大鼠体循环后，6 min血液中药物浓度即达最高点，即Tmax为(0.1±0.0)h，Cmax为(5 928.0±803.2)ng·mL-1，并且血药浓度随时间推移逐渐降低。由表1可知，大鼠口服和静脉注射去氢松香酸的绝对生物利用度(Fabs)为16.5%。

图2 大鼠去氢松香酸给药后血药浓度-时间曲线：口服10 mg·kg-1(A)、静脉注射1 mg·kg-1(B)

表1 大鼠静脉注射和口服去氢松香酸的药代动力学参数

3 结语

剂量确定实验中，口服灌胃给药3个剂量，10 mg·kg-1、100 mg·kg-1和500 mg·kg-1，每个剂量3只大鼠，连续观察大鼠生存状态和死亡情况，在14 d的观察期内，没有大鼠死亡，大鼠的体重也没有明显差异。本研究建立的方法灵敏准确，选择性好，方法验证都符合生物样品分析方法的基本要求，适用于大鼠血浆去氢松香酸的药代动力学研究。