吕航 李小冬 刘宏鹏 王顺 宿慧

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是骨密度及骨质量降低，骨微结构发生破坏的一种疾病[1]。酒精对骨密度和骨量存在较大影响[2]；酒精能对骨组织的异常代谢进行诱导，对成骨-破骨平衡进行破坏[3]。但目前尚未清楚酒精作用在哪个阶段来影响BMSCs抑成骨/促成脂分化的能力。祖国医学认为，酒精性骨质疏松症，以肾虚血瘀为主要病机，以补肾活血法主之[4]。人脐静脉间充质干细胞（human umbilical vein mesenchymal stem cells，hUV-MSCs）来源丰富，具有减轻和消除炎症、修复组织损伤等多种生物学功能，已越来越多地应用于器官损伤的治疗[5]。以往研究显示酒精对肾虚血瘀型OP的治疗有消极作用[6]，但关于酒精对hUV-MSCs治疗肾虚血瘀型OP分子机制方面的研究少见。基于此本研究将通过动物实验对此进行探讨，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康4周龄SD雄性大鼠40只，大鼠重量240～260 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（黑）2019-0004。

1.2 试剂、设备与细胞株

试剂：75%医用酒精（生产厂家：山东朱氏药业集团有限公司，批准文号：鲁卫消证字2015第1603号，配置为20%浓度）；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）ELISA检测试剂盒均购自北京博奥派克生物科技有限公司。

仪器：酶标仪（生产厂家：上海赛默科技生物发展有限公司，型号：DP-6100）；-80 ℃超低温冰箱（生产厂家：日本SANYO三洋电机，型号：MDF-C8V）；光学显微镜（生产厂家：日本奥林巴斯，型号：STT-300）；荧光显微镜（生产厂家：日本奥林巴斯，型号：LF50）；台式高速冷冻离心机（生产厂家：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号：H2050R）。

细胞株：人脐带间充质干细胞hUV-MSCs，购自广州吉妮欧生物科技有限公司。

1.3 动物造模及分组

采用酒精腹腔注射法制备肾虚血瘀型OP大鼠模型，造模成功后将SD大鼠随机分为酒精组、治疗组和对照组，每组10只。酒精组尾静脉注射酒精 [20%，10 ml/（kg·次），1次 /周 ]，对照组在酒精组基础上尾静脉注射hUV-MSCs（1次/周，107个细胞/次），治疗组停止酒精注射但尾静脉注射注射 hUV-MSCs（1次 /周，107个细胞 /次）；取SD大鼠10只腹腔注射法生理盐水作为假手术组，尾静脉注射生理盐水 [10 ml/（kg·次），1次 /周 ]。四组均连续治疗8周。

1.4 观察指标

处死大鼠后，取大鼠腰椎骨进行以下检测：（1）采用HE染色对大鼠骨组织的病理损伤情况进行检测，观察骨小梁面积变化。（2）采用TUNEL染色检测观察骨组织细胞凋亡情况，荧光显微镜观察FITC标记的TUNEL阳性细胞并拍照。（3）采用医学显微CT检测骨组织的骨体积分数（bone volume fraction，BVF）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）和骨小梁分离距离（trabecular separation/spacing，Tb.Sp）。（4）采用 ELISA 检测血清ALP和TRAP水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 统计学处理

采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验；计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组骨组织病理损伤的比较

假手术组、酒精组、对照组、治疗组大鼠骨组织骨小梁面积分别为（71.25±3.64）%、（38.19±2.57）%、（52.10±2.76）%、（56.31±2.90）%，四组大鼠骨组织骨小梁面积比较，差异有统计学意义（F=206.5，P＜0.05）。酒精组、对照组、治疗组大鼠骨组织骨小梁面积均小于假手术组（P＜0.05），治疗组与对照组大鼠骨组织骨小梁面积均大于酒精组（P＜0.05），治疗组大鼠骨组织骨小梁面积大于对照组（P＜0.05）。四组大鼠骨组织病理学HE染色情况，见图1。

图1 四组大鼠骨组织病理学HE染色情况（×100）

2.2 四组骨组织细胞凋亡情况比较

假手术组、酒精组、对照组、治疗组大鼠骨组织 TUNEL阳性细胞数分别为（5.16±1.08）、（36.29±2.43）、（27.18±2.05）、（24.71±2.36），四组比较大鼠骨组织TUNEL阳性细胞数比较，差异有统计学意义（F=407.5，P＜0.05）。酒精组、对照组、治疗组大鼠骨组织TUNEL阳性细胞数均多于假手术组（P＜0.05），治疗组与对照组大鼠骨组织TUNEL阳性细胞数均少于酒精组（P＜0.05），治疗组大鼠骨组织TUNEL阳性细胞数明显少于对照组（P＜0.05）。四组大鼠骨组织TUNEL阳性细胞荧光显色图片，见图2。

图2 四组大鼠骨组织TUNEL阳性细胞荧光显色图片（×200）

2.3 四组骨组织BVF、Tb.Th和Tb.Sp比较

四组骨组织BVF、Tb.Th和Tb.Sp比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。酒精组、对照组、治疗组大鼠骨组织BVF、Tb.Th均低于假手术组（P＜0.05），Tb.Sp均高于假手术组（P＜0.05）；治疗组与对照组大鼠骨组织BVF、Tb.Th均高于酒精组（P＜0.05），Tb.Sp均低于酒精组（P＜0.05）；治疗组大鼠骨组织BVF、Tb.Th均高于对照组（P＜0.05），Tb.Sp低于对照组（P＜0.05），见表 1。

表1 四组骨组织BVF、Tb.Th和Tb.Sp比较（±s）

表1 四组骨组织BVF、Tb.Th和Tb.Sp比较（±s）

*与假手术组比较，P＜0.05；#与酒精组比较，P＜0.05；△与对照组比较，P＜0.05。

组别 BVF（%） Tb.Th（mm） Tb.Sp（mm）假手术组（n=10） 31.60±2.98 0.079±0.003 0.13±0.04酒精组（n=10） 8.42±1.05* 0.034±0.002* 0.65±0.07*对照组（n=10） 17.53±2.14*# 0.048±0.005*# 0.54±0.06*#治疗组（n=10） 20.90±2.36*#△ 0.060±0.007*#△ 0.26±0.03*#△F值 175.8 167.2 235.0 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 四组血清ALP和TRAP水平比较

四组血清ALP与TRAP水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。酒精组、对照组、治疗组大鼠血清ALP与TRAP水平均高于假手术组（P＜0.05），治疗组与对照组大鼠血清ALP与TRAP水平均低于酒精组（P＜0.05），治疗组大鼠骨血清ALP与TRAP水平均低于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 四组血清ALP和TRAP水平比较（±s）

表2 四组血清ALP和TRAP水平比较（±s）

*与假手术组比较，P＜0.05；#与酒精组比较，P＜0.05；△与对照组比较，P＜0.05。

组别 ALP（U/L） TRAP（pg/ml）假手术组（n=10） 17.36±2.48 14.30±1.69酒精组（n=10） 60.17±3.95* 35.72±3.68*对照组（n=10） 41.60±2.72*# 26.47±2.16*#治疗组（n=10） 33.80±2.49*# △ 21.05±2.24*# △F值 357.5 125.6 P 值 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

酒精性OP是继发性OP，是指因人体长期大量饮酒引起骨量丢失，骨微观结构退化致使骨脆性增加的一种全身性骨骼疾病[6]。长期慢性饮酒可致多种疾病发生，酒精可干扰骨代谢，损害骨骼系统引起骨质疏松，导致骨折，为家庭带来沉重经济负担[7]。hUV-MSC能分化成为中胚层间质组织，具备自我更新及多向分化的潜能。hUV-MSCs来源丰富、取材操作方便、不涉及伦理学问题，能促进成骨细胞的增殖活性[8]。国外学者通过构建骨质疏松性下颌骨坏死大鼠模型，探讨脐带间充质干细胞的治疗效果，结果显示骨质疏松性下颌骨坏死大鼠骨再生明显增强，成骨细胞数量增高[9]。

以往有研究显示，长期酒精摄入可导致大鼠骨小梁数量减少、间隙增大、厚度降低，使骨骼弹性模量、最大载荷及破坏载荷等生物力学性能降低，骨骼抵抗外力性能下降，骨折风险明显增加[10]；还有研究显示，酒精可诱导骨髓间充质干细胞ROS水平及自噬水平升高，抑制成骨而促进成脂分化[11]。本研究结果显示，酒精组、对照组、治疗组大鼠骨组织骨小梁面积、BVF、Tb.Th均低于假手术组，骨组织TUNEL阳性细胞数、Tb.Sp及血清ALP、TRAP水平均高于假手术组（P＜0.05）；治疗组与对照组大鼠骨组织骨小梁面积、BVF、Tb.Th均高于酒精组，骨组织TUNEL阳性细胞数、Tb.Sp及血清ALP、TRAP水平均低于酒精组（P＜0.05）；治疗组大鼠骨组织骨小梁面积、BVF、Tb.Th均高于对照组，骨组织TUNEL阳性细胞数、Tb.Sp及血清ALP、TRAP水平均低于对照组（P＜0.05）。提示酒精对hUV-MSCs治疗OP大鼠有消极的影响。ALP是碱性磷酸的一种同工酶，由成骨细胞产生，是成骨细胞成熟和具有活性的标志，对了解成骨细胞的状态有重要意义。随着OP病情的进展ALP水平逐渐升高，表明其与骨质疏松有密切的关系[12-13]。TRAP过度表达的大鼠模型表现为骨质疏松。骨吸收时，破骨细胞附着在骨的表面，分泌的酸和蛋白酶在骨基质与破骨细胞之间形成一个空隙，磷酸酐酶和H+-ATP酶质子泵形成一个酸性环境，位于破骨细胞微粒体TRAP，即通过破骨细胞波状缘分泌进入此空隙，与其他酶一起参与骨基质中固体钙磷矿化物的降解[14-15]。

综上所述，酒精影响hUV-MSCs成骨/成脂分化平衡，进而影响了其在肾虚血瘀型OP中的治疗效果。