邹志卓 ， 黄 鹤 ， 许松姬

(延边大学医学院，吉林 延边朝鲜族自治州 133000)

肥胖是一种能量摄入大于能量消耗的代谢性疾病[1]。当今社会，随着经济发展、饮食结构调整和运动量减少，肥胖人数逐年增加[2]。肥胖是现今影响全球的公共卫生问题，是很多疾病的高危因素，如高血压、高血脂、脂肪肝、动脉粥样硬化、癌症等[3]。关于肥胖引起心血管疾病的研究很多，其中肥胖引起的脏器线粒体损伤[4-5]也受到广泛关注。本试验拟通过高脂饮食诱导大鼠肥胖，观察肥胖对其心脏、肝脏线粒体呼吸功能的影响，通过检测大鼠脏器线粒体呼吸控制率(Respiratory control ratio，RCR)和纯化线粒体磷氧比(Adenosine diphosphate/ Oxygen，ADP/O)，直观反映饮食诱导肥胖对其心脏、肝脏线粒体呼吸功能的影响，为进一步研究肥胖相关心血管疾病的线粒体损伤机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD清洁级雄性大鼠108只，体重(230±10)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016—0006，饲养于吉林医药学院动物实验室。

1.2 主要试剂 心脏和肝脏组织线粒体分离缓冲液A、B(自制)；磷酸盐(Phosphate buffered saline，PBS)缓冲液、ADP/O检测试剂盒、RCR检测试剂盒，均购自上海杰美基因医药科技有限公司。

1.3 分组及处理 大鼠适应性饲养1周。自由饮水和摄食，记录每天进食量，每周称量体重1次。高脂饲料饲养2周后，根据体重增加量降序排序，位于体重增加量上1/3的大鼠作为饮食诱导肥胖(Diet-induced obesity，DIO)组，位于体重增加量下1/3的大鼠作为饮食诱导肥胖抵抗(Diet-induced obesity resistance，DR)组，位于体重增加量中间的为正常对照(Control，CON)组，每组36只。DIO组和DR组给予高脂饲料，CON组给予基础饲料，持续喂养18周。

1.4 线粒体提取 为观察饮食诱导肥胖过程中心脏和肝脏线粒体呼吸功能的动态变化，在饮食诱导肥胖过程中第8、10、12、14、16周和第18周，分别从CON组、DIO组和DR组中每组随机选取6只大鼠处死，立即取心脏和肝脏组织置于预冷的PBS中。洗去血液，充分剪碎、匀浆，在4 ℃条件下使用低温离心机3 000 g离心5 min，弃上清，取沉淀。心脏组织用心脏分离缓冲液A(120 mol/L NaCl，20 mol/L HEPES，2 mol/L MgCl2，1 mol/L EGTA，5 g/L 牛血清白蛋白；pH 7.4)，600 g离心10 min，取上清，再次离心(4 ℃，17 000 g，10 min)，沉淀用心脏缓冲液B(300 mol/L 蔗糖，2 mol/L HEPES，0.1 mol/L EGTA；pH 7.4)重悬即制成心脏线粒体悬液。肝脏组织用肝脏分离缓冲液A (0.22 mol/L甘露醇,0.07 mol/L蔗糖,0.02 mol/L HEPES,2 mol/L Tris-HCl,1 mol/L EDTA；pH 7.2)，于4 ℃条件下1 000 g离心10 min，取上清，再次离心(4 ℃，16 000 g，4 min)，弃上清，取沉淀后使用肝脏缓冲液B(0.22 mol/L甘露醇,0.07 mol/L蔗糖,0.01 mol/L Tris-HCl,1 mol/L EDTA;pH 7.2)重悬即制成肝脏线粒体悬液。心脏和肝脏部分所有操作均在0～4 ℃进行。

1.5 ADP/O水平的测定 预热氧电极仪到37 ℃后加入2 mL介质液(Reagent A)到反应玻璃槽，开始记录氧浓度O1。1 min后加入50 μL待测的心脏线粒体悬液和肝脏线粒体悬液，持续1 min后加入10 μL底物液(Reagent B)。持续记录直至下行斜线出现拐点，记录氧浓度O2，继续加入10 μL底物液(Reagent B)，记录氧浓度O3，持续记录直至下行斜线出现拐点，记录氧浓度O4，按照公式(1)和公式(2)计算氧浓度降低值和线粒体磷氧比(ADP/O)。

氧浓度降低值=(O1-O2)+(O3-O4)

(1)

ADP/O=

(2)

1.6 RCR水平的测定 将2 mL介质液(Reagent A)加入到反应玻璃槽，开始记录氧浓度。1 min后加入50 μL待测的心脏线粒体悬液和肝脏线粒体悬液，持续1 min后加入10 μL底物液(Reagent B)——开始Ⅳ态呼吸。持续记录2 min，出现氧浓度缓慢下降，继续加入20 μL底物液(Reagent C)——开始Ⅲ态呼吸，持续记录直至下行斜线出现拐点，记录数据，按照公式(3)分别测算Ⅲ态呼吸速率和Ⅳ态呼吸速率,

(3)

并按照公式(4)计算RCR。

(4)

1.7 统计分析 连续变量用平均值±标准差(Mean±SD)表示，并使用独立样本t检验进行比较。所有的数据分析使用IBM SPSS程序(26版，SPSS公司，美国芝加哥)进行，所有的图表使用GraphPad Prism软件(8版，GraphPad Prism，美国加州圣地亚哥)进行。

2 结果

2.1 饮食诱导肥胖大鼠的体重变化 各组大鼠初始体重无差异，试验第1周开始，DIO组体重明显高于DR组(P<0.001)，第2周开始DIO组体重明显高于CON组(P<0.001)。试验第1、2、3、5、6、7、10、11周和第12周时，CON组大鼠体重明显高于DR组(P<0.05)，见表1。

表1 大鼠每周体重变化情况Table 1 Weekly weight change in rats

2.2 心脏线粒体RCR和ADP/O测定 DIO组大鼠心脏线粒体RCR在试验第16周和第18周时显著低于CON组(P<0.05)，DR组在第16周和第18周也表现出低于CON组的趋势，在第18周有统计学差异(P<0.05)，见图1。ADP/O结果与RCR表现出相似的趋势，均在第16周和第18周时，DIO组与DR组ADP/O水平显著低于CON组(P<0.05)，见图2。

图1 大鼠心脏线粒体呼吸控制率(A)和磷氧比(B)Fig.1 Rat heart mitochondrial respiratory control rate (A) and P/O ratio (B)a:DIO组与CON组比较，P<0.05； b:DR组与CON组比较，P<0.05a:Comparison between DIO group and CON group, P<0.05; b:Comparison between DR group and CON group, P<0.05

2.3 肝脏线粒体RCR和ADP/O测定 大鼠肝脏线粒体呼吸功能表现出较心脏更强的抵抗能力，RCR结果仅在第16周时出现了DIO组显著低于CON组(P<0.05)，其余时间点各组间均无统计学差异(P>0.05)(图2A)。ADP/O在第10周时，DIO组有高于CON组的趋势(P=0.057)，在第18周时，DIO组ADP/O显著低于DR组(P<0.05)，且有低于CON组的趋势(P=0.093)(图2B)。

图2 大鼠肝脏线粒体呼吸控制率(A)和磷氧比(B)Fig.2 Rat liver mitochondrial respiratory control rate (A) and P/O ratio (B)a:DIO组与CON组比较，P<0.05; b:DIO组与DR组比较，P<0.05a:Comparison between DIO group and CON group,P<0.05; b:Comparison between DIO group and DR group,P<0.05

3 讨论

肥胖个体易发生心肌脂类蓄积[6]、心肌耗氧量和脂肪酸氧化增加以及心肌效能降低；心肌线粒体呼吸功能降低和ATP合成减少，氧化磷酸化减弱，心肌解偶联蛋白3(Uncoupling protein 3,UCP3)表达增加[7]。一旦线粒体受到外界因素影响，富含线粒体的心脏将很快出现相关反应[8]。本试验发现，第8～16周时，与肝脏相比，心脏各组各项指标都出现了十分明显的变化。心脏线粒体对肥胖所致的损伤最为敏感。通过第14～18周心脏指标的变化，发现心脏在第16周时下降趋势减缓，但因为试验时间原因，不能确定心脏是否已出现了失代偿[9]。与肝脏相比，心脏出现失代偿的趋势更为明显，并且从最开始测定各组指标时，心脏的波动比肝脏更剧烈，说明心脏的线粒体损伤更严重。

在保持机体代谢平衡的各种脏器中，肝脏起至关重要的作用[10]。除了脂类代谢主要在肝脏中发生外，肝脏同时与骨骼肌一起保持机体的血糖平衡。本试验发现，高脂饮食喂养大鼠肝脏并没有出现明显的失代偿，这可能便是肝脏在脂类代谢和维持血糖平衡中发挥重要作用的原因。

本试验显示，高脂饮食可以引起大鼠心脏、肝脏线粒体损伤，其中大鼠心脏对肥胖所致的线粒体损伤尤为敏感，且心脏各项指标在较短时间内出现波动，而肝脏也在之后的短时间内出现指标波动。DR组大鼠比DIO组大鼠的线粒体代偿能力更强，这种现象在不同脏器均有体现，在肝脏中DR组大鼠各项水平与CON组更相近。虽然本次试验并未出现明显的失代偿，但是根据各项指标趋势可以推测，随着时间的进行，DR组大鼠出现失代偿的时间将晚于DIO组。得出上述试验结果的可能原因：在高脂饮食诱导过程中，DIO组大鼠体内在肥胖过程中会逐渐出现生理性代偿作用，不同程度地缓冲适应高脂肥胖给机体带来的一系列生理性损害。与此同时，大鼠各脏器及其线粒体含量、鼠种不同、饲养环境、鼠龄等都可能是出现不同试验结果的影响因素。