余政梁，丁光树，蔡惠鞠，王佳欣，孙 辉，李万水,*

（1. 公安部鉴定中心，北京 100038；2. 牡丹江市公安局，黑龙江 牡丹江 157000）

Y-STR因其男性遗传特点，常用于父系家族及亲缘关系排查，可为案件提供线索、确定侦查范围，故现场生物检材的Y-STR信息价值愈益受到重视并被挖掘[1-2]，围绕Y-STR复合扩增检测体系的研究亦成热点。DYS460位于Y染色体q11位置，公开信息显示其核心重复序列为[CTAT]n，是国内确定的核心Y-STR基因座之一，现包含于多个复合扩增体系中[3-5]。DYS460基因座在不同体系中的片段长度及等位基因范围见表1，在DNATyper17+28Y复合扩增体系中的等位基因范围为7～14，原片段长度在514～545 bp之间。等位基因标准品是保证分型准确的关键，其制备过程包括筛选等位基因分型、质粒与标准品制备等步骤[6-7]。对此，研究者首先要获得该基因座的序列，对序列进行分析以确定核心序列（核心序列一般具有唯一性），再根据核心序列的重复次数，制备出包含不同大小片段的质粒，通过扩增质粒最终获得基因座的等位基因标准品。当以不同体系进行分型验证比较时，若出现分型不一致，就需要查找异常的原因，多由侧翼序列改变及序列中包含两段核心重复序列导致。本研究在对DNATyper17+28Y复合扩增体系进行准确性验证时，发现部分样本DYS460基因座的分型与其他体系不一致，故而对DYS460基因座分型异常进行了探究，结果显示该基因座序列中有相邻的两段[CTAT]n重复序列，若选择其中不同的重复序列扩增分型，就会产生不同的分型结果。这一发现可为因核心重复序列选择差异所致分型异常的分析提供参考借鉴。

1 材料与方法

1.1 样本

标准品9948和2800（苏州新海生物科技股份有限公司），两名志愿者的血卡A与B及其用磁珠法提取的DNA；其中9948、血卡A的DYS460分型在DNATyper17+28Y体系和其他体系中一致，均为11；2800、血卡B的不一致，在DNATyper17+28Y体系中分别为10、12，而在其他体系中均为11。

1.2 DNA扩增与产物检测

设计DYS460基因座无荧光标记通用引物，见表2，扩增产物大小约1 000 bp，包含原荧光产物片段。扩增体系为50 μL，热启动前程序为72 ℃、20 min，95 ℃、11 min；扩增程序为94 ℃、30 s，60 ℃、2 min，72 ℃、1 min，55个循环；60 ℃、1 h，4 ℃保存。上述4份DNA样本用ProFlex PCR仪（Life Technologies , 美国）扩增。琼脂糖凝胶电泳确定片段大小。

表1 不同体系中DYS460基因座片段长度及等位基因范围Table 1 Amplicon sizes and alleles of DYS460 locus tested with different systems

表2 DYS460通用引物序列Table 2 Universal primers’ sequences for DYS460

1.3 DNA测序

对4个样本进行Sanger测序（生工生物工程股份有限公司，上海）。

2 结果

2.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果

采用本研究设计的通用引物对4个样本进行PCR扩增，扩增产物（用于测序）经琼脂糖凝胶电泳检测，结果目的条带单一、清晰，且与通用引物设计时所预判的片段大小相一致（图1）。

2.2 测序结果

对标准品9948、2800、血卡A和B的扩增产物DNA进行测序，在DNATyper17+28Y复合体系中， DYS460原设计引物之间的序列如表3示，分析发现，该基因座中有相距107 bp的两个数目可变的相同重复序列，其等位基因序列结构为5’-287bp-[CTAT]n- 107bp-[CTAT]m-54bp-3’，其中[CTAT]n距引物起始端287 bp。

图1 琼脂糖凝胶电泳结果（从左到右依次为9948、2800、血卡A、血卡B）Fig. 1 The results of the amplified products of 9948, 2800, blood cards A and B (from left to right) to undergo agarose gel electrophoresis

表3 4个样本的DNA测序结果Table 3 Sequencing results of four amplified products

对DNATyper17+28Y复合扩增体系中DYS460基因座的质粒序列进行分析，发现其构建的等位基因标准品是以[CTAT]n为核心重复序列命名，忽视了[CTAT]m，因而导致了分型异常。该体系DYS460基因座等位基因标准品核心序列重复数及对应片段大小见表4。4个样本其DYS460基因座[CTAT]n的重复次数分别为10、9、10、11，而[CTAT]m则均为11（比合成质粒对应位置增加了1次重复），导致它们DNATyper17+28Y体系所测最终分型为11、10、11、12。其他体系如DNATyperY36，因扩增片段短，仅包含[CTAT]m，4个样本分型均为11。

表4 DNATyper17+28Y体系中DYS460基因座等位基因标准品核心重复数及片段大小Table 4 The core repeats and fragment size of standard alleles of the DYS460 contained with DNATyper17+28Y system

3 讨论

构建STR扩增体系，要保证建立的不同体系能得到一致的分型。因侧翼序列改变造成分型不一致、等位基因丢失等情况已得到广泛关注[8-12]，然而对于序列中包含两段核心重复序列的情况报道较少，虽有关于DYS389Ⅰ和Ⅱ的研究[13]，但对DYS460则未见报道。对于DYS389基因座，设计一组引物，可同时扩增Ⅰ和Ⅱ（一般扩增的DYS389Ⅱ片段包含389Ⅰ），增加了其多态性。当序列中包含两段相同核心重复序列，但所在体系无法同时获得该两个等位基因分型，而易造成该基因座分型错误时，研究人员需要对两个核心重复序列进行甄别判断，并同时与其他体系中的核心重复序列作比较，从而最终选择确定一段核心重复序列用于等位基因的分型判定。以本研究为例，DYS460的目的片段中包含两段相同的核心序列，而检测时只能获得1个等位基因分型，原因在于两段可变序列造成的片段长度差异导致了个体分型的不同。为解决该问题，本研究对原引物序列进行了调整，使扩增片段中只包含一条核心序列，以此保证了DYS460分型的准确性。

综上，在构建STR扩增体系时，对于目的片段较大的基因座，有必要对序列进行比较分析，当该基因座序列中含有复杂重复序列时，如含有两段相同核心重复序列或侧翼区有固定的核心序列重复数时，应当仔细甄别，确定该基因座核心重复序列是否具唯一性，并根据核心重复序列命名规则确定等位基因标准品的分型，设计不同的引物或简并引物，且要与其他体系作比较验证，以保证分型准确无误。