李辉玲， 张建文， 李守明

(1.巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院，新疆库尔勒 8410001；2.石河子农业科学研究院，新疆石河子 832000)

大蒜(L.)别称胡蒜，是百合科葱属中重要的蔬菜植物，兼有药用价值，被誉为“植物黄金”，在我国山东、河南、江苏、河北以及新疆等地广泛种植。其生长时间短、病虫害较轻，并且其精、深加工产业已初步形成，使其走俏欧洲、美国。但是一直以来，大蒜品种的筛选鉴定工作还不深入，品种资源存在同名异物或同物异名现象，另外大蒜长年无性繁殖所产生的品种退化严重、相互引种但背景资料缺失等问题不利于优异大蒜品种的推广和应用。

遗传变异是指不同个体或不同种类之间的变异之和，本质上是遗传物质的碱基对排序和结构排序变化。遗传多样性工作的开展可以直观地了解种质资源的遗传结构和多样性水平，为育种工作中的品种区分、分组、父母本选择、野生稀有物种的保护等提供依据。通过传统的形态学鉴定方法来研究遗传多样性具有简单、直观的优点，但表观形态受基因、外部环境共同影响，只能间接反映其遗传物质的本质特征，并且可检测的信息量也较少，存在一定的缺陷和局限性。分子标记技术是基于DNA多态性建立起来的方法，DNA碱基双螺旋结构排列的顺序就是作物的遗传信息，因此直接分析和比较DNA的碱基序列结构是最优的遗传多样性分析方式。简单重复序列(SSR)标记广泛分布于植物基因组上，呈现共显遗传特性，具有丰富的多态性，目前被广泛应用于构建遗传连锁图谱、遗传多样性分析、数量性状座位(QTL)定位分析和品种纯度鉴定等领域。

综上所述，明确大蒜的遗传背景信息和种质资源多样性，不仅可为评价与鉴定大蒜品种提供科学依据、为育种工作提供理论支持，而且也为优异品种实现种子繁殖奠定了理论基础，并能加速优良品种的大面积推广。本研究以63份不同地区来源的大蒜为材料，运用50对SSR引物分析供试大蒜种质资源的遗传多样性，以期解决大蒜品种存在的同名异物问题，最终为大蒜资源的品种评价与鉴定提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试63份大蒜种质资源分别由巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院特色作物室、新疆维吾尔自治区农业科学研究院园艺所收集并提供，其中来自新疆的种质11份，来自云南的种质10份，来自甘肃、山东的种质各6份，来自河南的种质5份，来自河北的种质4份，来自辽宁、四川的种质各3份，来自安徽、湖南、陕西的种质各2份，来自贵州、江苏的种质各1份，野生资源7份(表1)。将63份大蒜种质资源于2021年4月初种植于巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院试验田及新疆维吾尔自治区农业科学研究院试验田内，按照常规田间管理。2021年6月每个品种随机采集5株嫩叶，未出苗的品种以鳞茎为材料，放置于液氮罐中处理后及时存贮于-80 ℃超低温冰箱内备用。试验时称取200 mg左右叶片，用天根生化科技(北京)有限公司生产的新型植物基因组DNA提取试剂盒抽提材料的DNA，80 mg左右鳞茎用传统的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)手提法提取DNA。

表1 63份大蒜种质的资源信息

1.2 DNA质量及浓度的检测

提取63份大蒜资源的DNA，DNA浓度和纯度用核酸检测仪(NanoDrop-1000)结合琼脂糖凝胶电泳法测定。根据测定值和前期优化的PCR体系所需的DNA模板浓度，将所有样品浓度稀释到 30 ng/μL，放置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 引物设计与合成

参考Barboza等的研究，共设计50对引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4 PCR扩增

根据前期优化试验，确定大蒜SSR-PCR反应体系(10 μL)：30.0 ng模板DNA、各0.5 μmol/L正反向引物、5.0 μL 2×PCR Mix，用dd HO补齐。扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，在不同引物的上、下游平均温度下退火45 s，72 ℃延伸90 s；30次循环的最后1个循环的延伸时间设为10 min；4 ℃保存扩增产物。

采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳结果分析扩增产物，电泳仪参数：120 V恒定电压，电流200 mA，时间75 min。电泳结束后小心拆胶，用银染法显色至条带清晰可辨，在医用胶片观察灯下拍照。

1.5 数据统计分析

根据扩增结果的重复性、扩增产物的条带数量及清晰程度、多态性表现等筛选表现较为优异的SSR引物。统计分析各个引物处理下每个样品扩增产物的电泳条带，同一迁移位置处有条带的记为1，无条带的记为0，缺失的记为9，组成1和0矩阵，在Excel表中登记。用NTSYS-pc(Version 2.10e)软件进行聚类分析并构建系统聚类图，计算遗传相似性系数(genetic similar coefficient，GS)和遗传距离(genetic distance，GD)。

2 结果与分析

2.1 DNA模板的检测

用1%琼脂糖凝胶电泳检测随机挑选的14份大蒜资源DNA的质量(图1中1～9为试剂盒提取，10～14为传统CTAB法提取)。如图1所示，所提DNA条带整齐一致、带型清晰、浓度均匀。核酸检测仪测定结果显示，所提DNA的/位于 1.85～2.00之间，浓度为61～93 ng/μL，可以稀释为30 ng/μL用于后续SSR-PCR分析。

2.2 SSR扩增结果

以6份生物学性状差异较大、亲缘关系较远的大蒜材料为模板，利用优化后的最佳SSR-PCR反应体系和循环数，对50对SSR引物进行筛选，淘汰扩增效果不佳、带型不好辨认的引物，最终筛选出33对引物对63份材料有特异性条带，特异性检出率为66%；共扩增出353条条带，其中多态性条带162条，多态性比例为45.89%(表2)。不同引物所得扩增产物的电泳结果存在明显差异，本试验中，每对引物可扩增出2～22条条带，多态性条带数共162条，每对前期多态性表现良好的引物平均产生4.9条条带。图2是引物ASM072在63份新疆大蒜及其野生蒜种中的扩增情况，平均每对引物能够扩增出10.69个位点，表明大蒜资源间的遗传多样性较为丰富，所用SSR标记多态性表现较好。

表2 筛选出的33对大蒜SSR多态性引物

2.3 SSR聚类分析

用33对多态性差异表现优异的引物对63份新疆大蒜及其野生蒜种进行聚类分析，结果表明，63份大蒜资源的遗传相似系数位于0.41～0.9之间。如图3所示，可在遗传相似系数0.5处将63份新疆大蒜及其野生蒜种分成4个大类群，其中第1类群包含40份材料；第2类群包含15份材料；第3类群包含7份材料，为7份野生资源；第4类群包含1份材料，为贵州毕节蒜。聚类结果表明，大部分地理区域位置相近或相同的品种被聚在一起，比如第2类群包含15份材料，其中8份资源主要来自云南地区；第3类群包含的7份材料全部来源于乌鲁木齐，为野生蒜，但也有少部分地理区域位置较远的蒜种被聚在一起，如来自山东潍坊的大蒜(1号)与来自新疆石河子的资源(4、5号)被聚到第1类群的小亚群中；来自山东金乡的大蒜(2号)与来自辽宁黑山、陕西汉中的资源(22、24号)聚到了第1类群的小亚群中，造成这种现象的原因很可能是地区间引种，说明不同区域间的大蒜资源存在一定的基因交流情况。非加权组平均法(UPGMA)聚类分析结果表明，本研究设计的SSR标记引物能够有效区分不同地域及距离来源的大蒜资源并相对精确地鉴定资源间的亲缘关系。基于相似系数的结果，进一步对SSR-PCR反应结果进行主坐标分析，发现前3个主坐标的多态性贡献值分别为 20.34%、8.39%和6.63%。对63份大蒜材料在第1、第2主坐标构成的二维图(图4)、3个主坐标构成的三维图(图5)中进行分类，由图4、图5可见，63份大蒜材料在第1、第2主坐标排序中可分为6类，其中22(云南独头4号)、46(阿合奇县大蒜)距离其他材料较远，因此将它们重新单独分组。

综合上述3个主坐标的分析结果，63份大蒜材料可分为6个类群。分析比较得出，图3、图4、图5的结果与63份大蒜材料的聚类分析结果基本一致。在主坐标的分析中，第2类群基本一致，可将聚类分析结果中的第3、第4类群归为1类，将聚类分析中的第1类群分为2个组群，主坐标分析后的分组结果和聚类分析后的分组结果大体一致。

3 讨论与结论

3.1 不同部位DNA提取的比较分析

一般通过取幼嫩组织来获得较高质量的DNA，既容易破壁又能够避免经过不同程度的发育后细胞内其他组分的干扰。在本研究中，利用大蒜鳞茎和叶片提取的DNA进行SSR-PCR得到的试验结果没有明显差别，说明SSR扩增反应中对模板DNA的质量没有太高要求，但试验中发现，从大蒜不同部位提取的模板DNA浓度和质量有很大差异。大蒜鳞茎中存在大量多糖，用试剂盒抽提除杂不充分，材料的用量不宜过多，最好控制在0.2 g以内，否则大量多糖成分会产生很多黏液，从而干扰抽提效果。综合试验结果，用大蒜不同部位取材抽提的DNA对扩增效果的影响很小，可根据实际情况，在保证产率及质量的前提下合理选择取材部位。

3.2 大蒜资源间遗传多样性分析

本试验利用33对多态性SSR引物将63份新疆大蒜及其野生蒜种分为6个大类群，大多数来自同一地域的材料被聚为1类，说明本研究开发设计的SSR引物能够有效区分不同地域距离来源的大蒜资源，有一定的应用价值。也有少部分地域距离较远的大蒜材料被聚为1类，说明大蒜材料背景来源复杂且不同地域间存在一定的基因交流情况。因此本研究选用的SSR引物可以判断不同品种或材料间是否有基因交流的现象，也可以用于分析种源间的亲缘关系。