路瑶 欧永玉 李钦 刘小清 郑悦 贾毓宁 丰杰

高血压是一种常见和多发的慢性心血管疾病，主要表现为体循环动脉血压升高，可分为原发性和继发性高血压，长期血压水平过高会出现靶向器官严重受损，威胁患者生命安全[1-2]。近年来，随着医学水平提高，原发性高血压病死率明显降低，但仍有部分患者靶向器官受损，发生不良心血管事件[3]。原发性高血压治疗过程中，最为关键的是药物的选择和使用，厄贝沙坦（Irbesartan）是一种长效高选择性血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）受体拮抗剂，能特异性地拮抗血管紧张素Ⅱ受体（AT1），属于二苯咪唑类化合物，口服后能迅速吸收，生物利用度为60%～80%，消除半衰期为11～15 h，是治疗高血压的一线药物之一，近年来在临床上广泛应用[4-7]。厄贝沙坦片为白色或类白色薄膜衣片，含有薄膜衣时，薄膜衣碎片通常很难研细，特别是肠溶衣（丙烯酸7 树脂），延展性较强，不易溶解和研磨，影响粉末的均匀性，从而影响厄贝沙坦含量测定结果的准确性。去掉包衣或薄膜衣会损失部分主药，导致含量下降。故应结合实际检测需要并综合考虑操作各方面因素，确定采用何种操作来检验厄贝沙坦的含量，达到不去除薄膜衣又不影响测定结果[8-9]。本文就研磨时间、有无预研磨操作及研钵材质进行研究，考察厄贝沙坦片中厄贝沙坦的含量情况，摸索确定最佳的厄贝沙坦含量测定方法。

1 仪器与试药

仪器：Agilent1260 型高效液相色谱仪、XPE105 型电子天平、KH-1000E 型超声仪。

试药：乙腈、甲醇使用色谱级，磷酸、三乙胺使用分析级，纯化水自制，厄贝沙坦对照品购自中国食品药品检定研究院（批号：100608-201804），科苏（厄贝沙坦片）（一致性评价）（0.075 g）由扬子江药业集团北京海燕药业有限公司提供，移液管、容量瓶等准确度等级为A 级。

2 相关材料

2.1 色谱条件

色谱柱：APLLO-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相：磷酸溶液：乙腈（62∶38），检测波长：245 nm，柱温：30℃，流速：1.0mL/min，进样量：10 μL。

2.2 系统适用性溶液

分别取105℃干燥至恒重的厄贝沙坦对照品与杂质I对照品各适量，加甲醇溶解并稀释制成每1 毫升中各约含0.1 mg 的混合溶液，摇匀即得，作为系统适用性溶液。

2.3 对照品溶液

精密称取105℃干燥至恒重厄贝沙坦对照品约40 mg，置200 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定量稀释制成每1 毫升中含0.2 mg 的溶液，摇匀即得，作为对照品溶液。

2.4 待测样品溶液

取厄贝沙坦片20 片，精密称定计算平均片重，将厄贝沙坦片研磨，取研磨后的样品细粉（约相当于厄贝沙坦20 mg），置100 mL 量瓶中，加甲醇适量，超声10 min 使厄贝沙坦溶解，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为待测样品溶液。

3 实验方法和结果

按照Chp2015 版四部药品质量标准分析方法验证指导原则开展实验。

3.1 系统适用性试验

在高效液相色谱法中，色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个关键参数[10-12]。其中理论塔板数是柱效的具体体现，对实验结果产生直接影响。故用规定的系统适用性试验，取10 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为杂质I 峰与厄贝沙坦峰，杂质I 峰与厄贝沙坦峰的分离度应大于2.0，理论板数按厄贝沙坦峰计算不低于2 000。以杂质I 峰与厄贝沙坦峰的分离度及厄贝沙坦峰的理论塔板数为指标，考察系统的适用性[13-14]。

按要求对色谱系统进行适用性试验，出峰顺序、分离度、理论板数均符合国家药品监督管理局YBH07772019 含量测定项下要求。

3.2 专属性试验

取空白溶液、对照品溶液和待测样品溶液，取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，样品溶液主峰的保留时间与对照品溶液主峰保留时间一致，空白溶液在主峰位置应无干扰色谱峰。

样品溶液与对照品溶液两者主峰保留时间一致，空白溶液在主峰位置均无干扰色谱峰。

3.3 线性

精密称取105℃干燥至恒重厄贝沙坦对照品约40 mg，置200 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定量稀释制成每1 毫升中含0.2 mg 的溶液，分别量取1.0、4.0、5.0、6.0、10.0 mL，置10 mL 的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度制成各浓度线性溶液。取10 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图。

以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，绘制标准曲线。在（0.04～0.40）mg/mL 浓度范围内，主峰浓度与峰面积的线性关系良好。

3.4 检测限和定量限试验

检测限：取105℃干燥至恒重厄贝沙坦对照品加甲醇溶解并不断稀释成主峰与噪音峰信号的强度比约为3 时，得到被检测出的最低浓度即为检测限浓度[15-16]，取检测限溶液分别进样3 针注入液相色谱仪，记录色谱图。

连续进样3 针主峰峰面积及保留时间的重复性相对标准偏差均不大于2.0%，检测限的浓度为0.038 μg/mL。

定量限：取105℃干燥至恒重厄贝沙坦对照品加甲醇溶解并不断稀释成主峰与噪音峰信号的强度比约为10 时，得到定量检测出的浓度即为定量限浓度[15-16]，取定量限浓度分别进样6 针注入液相色谱仪，记录色谱图。

连续进样6 针主峰峰面积及保留时间的重复性相对标准偏差均不大于2.0%，检测限的浓度为0.13 μg/mL。

3.5 精密度试验

取厄贝沙坦片20 片，精密称定计算平均片重，将厄贝沙坦片研磨，取研磨后的样品细粉（约相当于厄贝沙坦20 mg），置100 mL 量瓶中，加甲醇适量，超声10 min 使厄贝沙坦溶解，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液制成6 份，由一个检测人员分别取10 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图。

所得6 份样品溶液中，主峰峰面积及保留时间的重复性相对标准偏差均不大于2.0%，说明该方法重复性及仪器精密度良好。

3.6 溶液稳定性试验

精密称取105℃干燥至恒重厄贝沙坦对照品约40 mg，置200 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定量稀释制成每1 中含0.2 mg 的溶液，分别在室温下放置0、4、8、12、18、24、36、42、48 h 后取10 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图。

取厄贝沙坦片20 片，精密称定计算平均片重，将厄贝沙坦片研磨，取研磨后的样品细粉（约相当于厄贝沙坦20 mg），置100 mL 量瓶中，加甲醇适量，超声10 min使厄贝沙坦溶解，并用甲醇稀释至刻度摇匀即得，分别在室温下放置0、4、8、12、18、24、36、42、48 h 后取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。

对照品溶液在室温放置0、4、8、12、18、24、36、42、48 h 后，各个时间点主峰峰面积与0 h 的峰面积比值均在98.0%～102.0%范围内。

样品溶液中，在室温放置0、4、8、12、18、24、36、42、48 h 后，各个时间点主峰峰面积和0 h 的峰面积RSD%小于2.0%。

表明对照品溶液和样品溶液在室温条件下放置48 h 内稳定。

3.7 加样回收试验

称取不含主成分的阴性空白制剂约20 mg，分别加入主成分16、20、24 mg 各3 份，分别置100 mL 容量瓶中，并用甲醇稀释至刻度摇匀即得，制得浓度分别为80%、100%和120%的样品溶液，共9 份。取空白溶剂、对照品溶液及不同浓度的回收率样品溶液各10 μL，按2.1 项下色谱条件进行测定，记录色谱图。

按外标法计算加样回收率，结果见表1。平均回收率（n=9）为98.37%。

表1 厄贝沙坦加样回收试验结果（n=9）

4 含量测定

精密量取2.2 项下系统适用性溶液、2.3 项下对照品溶液和2.4 项下样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪。进行不同研磨时间，有无预研磨操作，不同材质研钵对厄贝沙坦含量测定结果的影响试验。

实验1：取3 批厄贝沙坦片（批次分别是20071651、20090951、20101051）各20 片，每批样品在陶瓷研钵中分别研磨2、3、5 min，按照2.4.样品溶液的制备方法进行制备，测定厄贝沙坦片中厄贝沙坦的含量。从表2 及图1 中可以看出，研磨时间由2 min 到3 min，厄贝沙坦片的含量依次降低，说明研磨时间的延长，导致陶瓷研钵吸附继而会导致厄贝沙坦含量结果的降低。3 min 到5 min 结果基本一致，趋于平缓，说明研磨吸附饱和后，不会再影响厄贝沙坦片的含量测定结果。

图1 不同研磨时间对厄贝沙坦片含量测定结果的影响

表2 不同研磨时间对厄贝沙坦片含量测定结果的影响（%）

实验2：针对陶瓷研钵吸附问题，采用预研磨和不预研磨开展实验，按下述方法进行测定。（1）预研磨操作：取批号为21032251 的厄贝沙坦片10 片，在陶瓷研钵中研磨5 min，弃去内容物，另取该批厄贝沙坦片20 片，在上述陶瓷研钵中研磨3 min，混匀后按照2.4 样品溶液的制备方法进行制备，测定厄贝沙坦片中厄贝沙坦的含量；（2）不预研磨操作：取批号为21032251 的厄贝沙坦片20 片，在陶瓷研钵中研磨3 min，混匀后按照2.4 样品溶液的制备方法进行制备，测定厄贝沙坦片中厄贝沙坦的含量。从表3可以看出，陶瓷研钵预研磨的厄贝沙坦片含量结果要高于未经过预研磨的陶瓷研钵测定出的含量。这也验证了实验1中的结论，陶瓷研钵吸附会影响含量测定结果。

表3 预研磨与不预研磨操作对厄贝沙坦片中厄贝沙坦含量的影响对比（%）

实验3：不同研钵材质、研磨操作对厄贝沙坦片含量测定结果的影响。（1）取批号为21032251 的厄贝沙坦片10片，在陶瓷研钵中研磨5 min，弃去内容物，另取厄贝沙坦片20 片，在陶瓷研钵中研磨3 min，混匀后称取三份平行样品，按照2.4 样品溶液的制备方法进行制备，测定厄贝沙坦片中厄贝沙坦的含量。（2）取批号为21032251 的厄贝沙坦片20 片，在玛瑙研钵研磨3 min，混匀后称取三份平行样品，按照2.4 样品溶液的制备方法进行制备，测定厄贝沙坦片中厄贝沙坦的含量。从表4 数据来看，更换不同材质研钵，玛瑙研钵研磨与使用陶瓷研钵预研磨进行测定，对厄贝沙坦片含量测定结果几乎相差不大，更加证明研钵材质不同，对厄贝沙坦吸附影响不同，导致厄贝沙坦含量测定结果不同。

表4 同一批样品采用陶瓷研钵预研磨与玛瑙研钵不预研磨的测定结果（%）

5 讨论

在厄贝沙坦片含量测定过程中，决定研磨效果的主要因素有：被研磨物的料性，研磨的材质，研磨压力及研磨的速度等[17]。本文针对不同的研磨时间，考察陶瓷研钵对厄贝沙坦的吸附影响。针对吸附问题，对比有无预研磨操作对厄贝沙坦含量测定结果的影响。此外，对比陶瓷、玛瑙不同材质的研钵对厄贝沙坦含量测定结果的影响，找出影响厄贝沙坦含量测定结果的影响因素。综上所述，选择合适的研磨时间，及研磨操作方式、研钵材质，能够较真实的反映出厄贝沙坦片中厄贝沙坦的实际含量。从实验结果来看，为减少陶瓷内表面粗糙导致的吸附，可使用玛瑙研钵直接研磨样品进行厄贝沙坦的含量测定。若无玛瑙研钵，可使用陶瓷研钵进行样品预研磨，使研钵吸附饱和样品后，再进行厄贝沙坦的含量测定。