王博锐，尚建丽，许丹丹，王德国

(1.河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471000；2.许昌学院 食品与药学院；河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室，河南 许昌 461000)

随着人们消费水平的提高，消费者逐渐倾向于高蛋白含量、低脂肪含量肉类[1].羊肉营养价值丰富，蛋白质含量高且优质，脂肪含量较低[2].目前，肉类掺假是常见的食品安全问题.羊肉及羊肉制品掺假的检测技术有感官鉴别法[3]、同位素质谱法[4]、酶联免疫吸附法[5]、红外光谱[6]、核酸检测技术[7]等.其中传统方法各有优缺点.核酸检测方法因特异性强、灵敏度高和结果更加准确而被广泛应用于物种鉴定[8].因此，亟需建立一种方便、快速，能够广泛应用于基层的羊肉制品检测方法.

梯型熔解温度等温扩增技术(LMTIA)是2021年WANG[9]等通过借鉴环介导等温扩增技术(LAMP)[10]和PCR技术等开发的一种新型核酸扩增技术，该方法适用范围广、反应时间短、操作简单，且灵敏度高、特异性强.截至目前，还没有使用LMTIA进行羊肉的源基因检测研究.因此，通过建立LMTIA检测羊肉源性成分的方法，以期为羊肉掺假检测提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

羊肉、鸡肉、鸭肉、猪肉均购于许昌喜盈门超市；狗肉、猫肉购于淘宝.

试剂：通用型Real-time LMTIA反应预混液，德歌生物技术(山东)有限公司；DEPC处理水，生工生物工程(上海)股份有限公司；引物，通用生物系统(安徽)有限公司；磁珠法动物DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司.

仪器：Eppendorf移液枪，德国艾本德股份公司；电热恒温水浴锅，常州普天仪器制造有限公司；高速冷冻离心机，德国Sigma公司；实时荧光定量PCR仪，鲲鹏基因(北京)科技有限责任公司；电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；立式低温冰箱，青岛海尔集团有限公司；匀浆机，上海净信科技；Nano Drop One超微量核酸蛋白测定仪，美国Thermo Fisher Scientific公司.

1.2 试验方法

1.2.1 LMTIA靶序列的选择及引物设计

根据LMTIA引物设计方法，在GenBank上查找筛选羊肉转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)(GenBank ID：HM437212.1)上符合梯型结构的序列，并使用BLAST对比其序列特异性，最后以所选靶序列使用引物设计软件Primer 3 Plus设计LMTIA引物.

1.2.2 DNA制备

羊肉的DNA提取：根据磁珠法动物DNA提取试剂盒说明书操作提取羊肉的DNA.用电子天平称取羊肉的肌肉组织30 mg(剔除脂肪和筋腱组织)，剪碎，放置于2 mL离心管中，按照试剂盒的操作方法进行DNA的提取.最终得到模板DNA，小心吸取溶液，将其转移至新的离心管中，振荡混匀，并将其置于-20 ℃冰箱中保存，提取的羊肉DNA主要用于建立LMTIA反应体系.

1.2.3 LMTIA反应温度优化

以10 μL体系进行LMTIA反应体系的优化，10 μL反应体系中包括3.6 μL通用型Real-time LMTIA预混液，0.06 μL引物F和引物B，0.02 μL引物LF和引物LB，2 μL羊肉DNA，然后加入DEPC水补足10 μL.用Step One Plus PCR仪分别在55、56、57、58 ℃进行恒温扩增反应.

1.2.4 LMTIA的特异性测试

用鸡肉、鸭肉、猪肉、猫肉、狗肉的DNA测试LMTIA的特异性，使用TIANGEN公司的磁珠法动物组织基因组DNA提取试剂盒提取几种肉的DNA，提取出来的DNA作为模板进行测试LMTIA的特异性.

1.2.5 LMTIA灵敏度测试

将提取出来的羊肉DNA用DEPC水分别稀释至10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL，用移液枪分别移取每个梯度的DNA溶液作为DNA模板加入LMTIA反应体系中，测试LMTIA的灵敏度.

1.2.6 羊肉检测限的确定

以鸡肉为基底，制备羊肉不同质量比例的混合模拟肉样(0.1%、0.5%、1%、5%、10%)，用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱法)分别提取模拟肉样的DNA，羊肉质量占两者总质量的百分比分别为0.1%、0.5%、1%、5%、10%.首先分别称取一定量(>5 g)的羊肉和鸡肉的肌肉组织，置于5 mL的离心管中，用匀浆机将其研磨彻底，为后续称量做准备.然后分别按比例称取0.1%(1.998 g鸡肉+0.002 g羊肉)、0.5%(1.99 g鸡肉+0.01 g羊肉)、1%(0.198 g鸡肉+0.002 g羊肉)、5%(0.047 5 g鸡肉+0.002 5 g羊肉)、10%(0.045 g鸡肉+0.005 g羊肉)的混合肉.使用TIANGEN公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱法)提取DNA，即可得到不同羊肉质量百分比的混合肉的模板DNA.将提取出来模板DNA加入LMTIA反应体系中，进行LMTIA反应，测试掺假肉中羊肉的检测限.

2 结果与讨论

2.1 LMTIA引物的确定

经过在GenBank上查找，并使用Oligo 7引物设计软件分析筛选，确定的羊肉特有序列如图1所示，序列的熔解温度曲线形状呈梯型.

图1 靶序列的梯型熔解曲线

图1所示的序列为靶标，使用Primer 3 Plus引物设计软件进行LMTIA引物的设计，所设计的引物序列如表1所示.

表1 羊肉引物序列

2.2 LMTIA温度的确定

用Step One Plus PCR仪分别在55、56、57、58 ℃进行LMTIA等温扩增反应.如图2所示，阴性对照均未出现扩增，羊肉DNA均扩增，结合扩增效率选择55 ℃为最适温度.

图2 LMTIA温度优化结果图

2.3 LMTIA的特异性

用Step One Plus PCR仪，在55 ℃下进行LMTIA扩增反应，阴性对照(DEPC水)、鸭肉、鸡肉、猪肉猫肉和狗肉的DNA均未出现扩增现象，只有阳性对照(羊肉DNA)出现了扩增反应，如图3所示.结果表明，羊肉DNA模板的CT值与其他肉类差异明显，说明该引物特异性较好，可用于羊肉中特异性基因的检测.

图3 LMTIA特异性结果图

2.4 LMTIA的灵敏度

将梯度稀释后的DNA稀释液作为模板加入LMTIA反应体系中，于55 ℃下测试LMTIA的灵敏度，结果如图4所示：DNA浓度为100 pg/μL时，未出现扩增现象；浓度为1和10 ng/μL时，均出现扩增反应，因此，该LMTIA体系的灵敏度为1 ng/μL.

图4 LMTIA灵敏度结果图

2.5 肉制品中羊肉源基因的检测限

将1.2.6中所提取的不同质量分数的羊肉DNA加入LMTIA反应体系中，在所优化的最适温度下进行LMTIA扩增反应，结果如图5所示.质量分数为0.1%的混合肉样在28循环处出现扩增，阴性对照无扩增.因此，该方法可检测出混合肉样中掺入质量分数为0.1%的羊肉源成分.

图5 LMTIA检测限结果图

3 结论

研究建立了肉制品中羊肉源成分LMTIA检测方法.该方法根据羊肉的特异性基因序列设计特异性引物，通过特异性与灵敏度测试，最终确定LMTIA方法反应体系.在55 ℃反应温度下，该方法的特异性良好，最低检测细胞核DNA浓度可达到1 ng/μL.该方法反应时间短，不到30 min，相较于LAMP检测技术，LMTIA可节约至少一倍的反应时间.此外，该方法通过对模拟混合肉样进行检测限测定，可检测出羊肉质量比在0.1%的混合肉及肉制品，在一定程度上为羊肉的掺假造假检测提供技术支持，为其他肉类掺假检测研究提供了借鉴，对于市场上的羊肉掺假检测具有参考价值.