李翠，温远珍，曹晖，华杰，李婷，杨静，许彦

[1.暨南大学药学院，广东 广州 510632；2.盈科瑞（横琴）药物研究院有限公司/国家中药现代化工程技术研究中心新型递药系统分中心/广东省雾化吸入制剂工程技术研究中心，广东 珠海 519000；3.浙江维康药业股份有限公司，浙江 丽水 323000]

吸入液体制剂系指供雾化器用的液体制剂，即通过雾化器产生连续供吸入用气溶胶的溶液、吸入混悬液、吸入用溶液（需稀释后使用的浓溶液）和吸入用粉末（需溶解后使用的无菌药物粉末）[1]。吸入液体制剂具有局部给药，起效迅速、使用方便，避免肝脏首过效应，减少全身给药可能产生的不良反应等优点，是治疗哮喘、肺气肿、慢性阻塞性肺病（COPD）等疾病较为有效的途径，因此市场前景广阔[2-3]。

银黄注射液由金银花、黄芩提取物组成，被广泛应用于上呼吸道感染、急慢性咽炎、急慢性扁桃体炎等外感性疾病的治疗，国内临床上有将其雾化吸入用于治疗呼吸系统疾病的报道，疗效显著[4]。目前，国内尚无中药雾化吸入溶液上市。尽管临床上有不少中药注射液采用雾化吸入给药，治疗呼吸道疾病效果良好的报道，但均为超说明书范围使用，存在安全隐患。银黄吸入溶液在已上市银黄注射液的基础上改良开发而成，含金银花、黄芩提取物，目前处于临床前研究阶段。

吸入液体制剂的疗效除与药物自身理化性质有关外，所使用雾化器的性能亦是重要的组成部分。目前，市售雾化器按照工作原理分为射流雾化器、超声雾化器和振动筛孔雾化器3类，其中射流雾化器是使用最广泛的雾化器，主要有以下几方面优势：①可使药液微粒直径在5 μm以下，到达小气道及肺泡，达到高效的吸入；②不产生高温，无药物应用限制；③药液量较少，最大药液量一般为8 mL；④雾化时间较短[5-6]。

递送速率、递送总量和空气动力学粒径分布是评价体外雾化特性的重要指标。空气动力学粒径分布是评估吸入制剂是否有效雾化的关键体外质量控制项目，《中国药典》2020年版使用新一代撞击器（NGI）作为吸入溶液剂空气动力粒径分布（aerodynamic particle size distribution,APSD）的测量仪器。目前，常用的空气动力学评价参数微细粒子剂量（fine particle dose,FPD）、微细粒子分数（fine particle fraction,FPF）、空气动力学质量中值粒径（mass median aero-dynamic diameter，MMAD）和几何标准偏差（geometric standard deviation,GSD）。递送速率及递送总量是评价药物递送效率的重要依据[7-8]。本研究采用呼吸模拟装置模拟正常成人的呼吸模式，考察5种不同品牌、型号的射流雾化器对银黄吸入溶液体外评价的影响，以期优选出适合银黄吸入溶液性能的最佳雾化器，为中药雾化吸入给药的体外评价提供借鉴。

1 仪器与试药

1260 InfinityⅡ超高液相液相色谱仪（配备二极管阵列检测器，Open-LAB工作站，美国安捷伦公司）；SQP型（十万分之一）电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；BRS2100呼吸模拟器（英国科普利公司）；SB-1637新一代药物撞击器（NGI，英国科普利公司）；LCP-5真空泵（英国科普利公司）；TPK-2100流量控制器（英国科普利公司）；冷却装置（英国科普利公司）；DFM2000电子流量计（英国科普利公司）；Master-s15型纯水机（上海和泰仪器有限公司）；BRS滤膜（英国科普利公司）；MOC滤膜（英国科普利公司）。

雾化器A、B、C、D、E分别是市场上常用的5种品牌或型号射流雾化器。

银黄吸入溶液[批号：CP-201229-01，盈科瑞（横琴）药物研究院有限公司]；黄芩苷对照品（批号：110715-201821，纯度：95.4%，中国食品药品检定研究院）；水为去离子水，甲醇、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄芩苷的含量测定

2.1.1 色谱条件Welch Ultimate®XB-C18为色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-水-磷酸（体积比50∶50∶0.2）为流动相；检测波长为274 nm；进样量为10 μL。按外标法以峰面积计算样品中黄芩苷含量，理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2 500。色谱图见图1。

图1 银黄吸入溶液的HPLC色谱图Figure 1 HPLC chromatograms of Yinhuang solution for inhalation

2.1.2 对照品溶液的制备取黄芩苷对照品10.56 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备精密量取本品1 mL置10 mL量瓶中，加入50%（体积分数，下同）甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 标准曲线的建立精密量取不同体积的黄芩苷对照品适量，加50%甲醇稀释至刻度，并制成质量浓度为12.26、24.52、49.04、98.08、201.5 μg/mL的系列对照品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件测定，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得标准曲线Y=33.762 6X-76.094 6（r=0.999 7），线性范围为0.122 6～2.015 μg。

2.1.5 精密度试验取同一供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，计算黄芩苷峰面积的RSD＜2.0%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验取同一批银黄吸入溶液，按“2.1.3”方法制备供试品溶液，平行6份，按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果黄芩苷含量的RSD＜2.0%，表明方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验取同一批银黄吸入溶液，按“2.1.3”方法制备供试品溶液，分别在制备后0、2、4、8、16、24、36、48 h按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果黄芩苷峰面积的RSD＜2.0%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.1.8 加样回收率试验精密吸取已知黄芩苷含量的银黄吸入溶液，加入一定量的对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，平行6份，按“2.1.1”项下色谱条件测定，按外标法计算回收率。结果平均加样回收率为98.66%，RSD为2.0%，表明方法准确度良好。

2.2 雾化特性测定洗涤溶液的考察

含量测定中使用50%甲醇作为供试品溶液制备的稀释溶剂，由于甲醇毒性较大，采用甲醇溶液作为洗涤溶剂会对操作员的身体造成伤害，因此，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，稀释溶剂分别为20%乙醇溶液与50%甲醇溶液，对比两种溶液对黄芩苷含量测定的影响，结果20%乙醇溶液与50%甲醇溶液黄芩苷含量分别为4.703 mg/mL和4.796 mg/mL，两者偏差＜2%，说明无明显差异，选择20%乙醇溶液作为洗涤溶液。

2.3 数据处理

采用SPSS 22.0统计学软件处理，数据均采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.4 微细粒子空气动力学特性的测定

参照2020年版《中国药典》四部通则0951测定法[1]进行检测。预先使冷柜降至5℃，将NGI放置冷柜中90 min，开启真空泵并调节流速至15 min/L。精密量取银黄吸入溶液2 mL，置入雾化杯中，连接装置，开启雾化器雾化15 min，关闭雾化器和真空泵。分别用20%乙醇洗涤各部件，雾化器洗涤液置50 mL量瓶，人工喉、Stage1～2、Stage7和MOC洗涤液置5 mL量瓶，Stage3、Stage6洗涤液置10 mL量瓶，Stage4、Stage5洗涤液置20 mL量瓶，用20%乙醇稀释至刻度，使用高效液相色谱法测定各部件洗涤液中黄芩苷含量。按上述方法选用不同雾化器进行检测，每个雾化器平行测定3次，将各部件洗涤液测定结果导入到CopleyCitdas V3.10软件计算，可得FPD、FPF、MMAD及GSD。测定装置见图2，测定结果见表1及图3。

图2 微细粒子空气动力学特性测定装置Figure 2 Device for measuring aerodynamic characteristics of fine particles

图3 不同雾化器的微细粒子空气动力学特性气泡图Figure 3 Bubble chart of fine particle aerodynamic characteristics of different nebulizers

表1 不同雾化器的空气动力学分析Table 1 Aerodynamic analysis of different nebulizers（±s,n=3）

表1 不同雾化器的空气动力学分析Table 1 Aerodynamic analysis of different nebulizers（±s,n=3）

注：同一列数据比较，不同字母间表示差异有统计学意义，即P＜0.05。

雾化器雾化器A雾化器B雾化器C雾化器D雾化器E FPD/mg 4.212±0.8a 2.802±6.0b 2.664±3.9b 2.682±6.9b 1.755±9.4c FPF/%69.753±2.3a 50.995±2.9b 51.896±2.7b 50.062±4.0c 46.882±3.3d MMAD/μm 3.534±2.9a 4.776±3.9b 4.676±2.6b 4.832±3.6c 5.096±3.1d GSD 1.896±0.3a 2.148±1.7b 2.136±0.5b 2.150±1.5b 2.068±0.8b

根据结果可知，雾化器A和雾化器E与其他型号雾化器差异有统计学意义，气泡图显示为离散点。雾化器B、雾化器C和雾化器D雾化器之间差异无统计学意义，气泡图显示为聚集点。综合空气动力学结果最佳的是雾化器A，测得MMAD及GSD值最小，FPD及FPF值最大，说明MMAD最小，粒径分布最窄，小于5 μm的气溶胶药物的质量及占比最大。空气动力学结果最差的是雾化器E。雾化器B、雾化器C和雾化器D 3个型号雾化器结果介于两者中间。

2.5 递送速率和递送总量的测定

参照2020年版《中国药典》四部通则0111的方法[1]，组装过滤器和呼吸模拟器。将2 mL本品注入雾化杯中，由适配器连接雾化器与过滤装置，确保所有连接处密封。调节呼吸模拟器按成人模式运行（潮气量500 mL，吸呼比1∶1，频率：15 r/min，波形：正弦曲线）。同时开启雾化器和呼吸模拟器，60 s时关闭雾化器，取出吸入滤膜1，用20%乙醇溶液冲洗稀释至10 mL。更换新的吸入滤膜2，同时开启雾化器和呼吸模拟器，直至雾化结束（雾化15 min），关闭雾化器，用20%乙醇溶液冲洗雾化杯、吸入滤膜2及呼出滤膜，稀释至50 mL。采用高效液相色谱法测定上述洗涤液中黄芩苷含量，递送速率为吸入滤膜1中黄芩苷含量与雾化时间的比值，递送总量为吸入滤膜1和2中黄芩苷含量之和，呼出总量为呼出滤膜中黄芩苷含量，药杯残留为雾化杯中黄芩苷含量，回收率为测得总量（各部件中黄芩苷含量总和）与给药量的百分比。按上述方法选用不同雾化器进行测定，每个雾化器平行测定3次。测定装置见图4，测定结果见表2。

表2 不同雾化器的递送数据Table 2 Delivery data of different nebulizers（±s,n=3）

表2 不同雾化器的递送数据Table 2 Delivery data of different nebulizers（±s,n=3）

注：同一列数据比较，不同字母间表示差异有统计学意义，即P＜0.05。

雾化器雾化器A雾化器B雾化器C雾化器D雾化器E递送速率/（μg·s-1）7.258±3.3a 14.334±2.1b 14.766±10.7b 7.526±8.2a 7.955±9.6a递送总量/mg 2.806±5.2a 3.580±3.2b 2.649±7.2a 2.826±7.0a 1.276±9.9c呼出总量/mg 0.526±16.6a 1.262±7.3b 0.434±11.4a 0.509±12.1a 0.097±8.7c药杯残留/mg 6.219±4.4a 5.592±2.4b 5.209±0.42b 5.000±14.0b 6.090±3.2a回收率/%95.50±0.9a 104.39±0.7b 82.93±3.1c 83.603±4.7c 74.69±1.5d

图4 递送速率和递送总量测定装置图Figure 4 Device diagram for measuring delivery rate and total delivery

结果发现，雾化器C递送速率最快，与雾化器B的递送速率差异无统计学意义，其余3款雾化器的递送速率差异无统计学意义。由递送总量和呼出总量结果可知，雾化器B最高，雾化器E最低，其余3款雾化器差异无统计学意义。雾化器E递送总量和呼出总量值低的原因是实验过程中发现该款雾化杯无上盖，不能密封，在雾化过程中，大量雾化液滴从雾化杯上口喷出，导致收集到活性物质少。药杯中残留量最少的是雾化器D，雾化器D、雾化器B和雾化器C药杯残留量差异无统计学意义，雾化器A药杯中残留量最多。雾化器A及雾化器B的回收率均大于95%，说明该雾化器上盖的设计可有效阻止雾化液滴在呼气时喷出，且采用上述洗涤方式可以将各部件中的黄芩苷收集完全，滤膜对药物无吸附作用。

3 讨论

雾化吸入疗法是呼吸系统相关疾病的重要治疗手段之一，因其临床应用优势被国内外广泛使用。肺部是雾化吸入给药的重要作用部位，但并非所有药液经雾化后，雾化颗粒都能沉积肺部，进入呼吸道的粒子会发生惯性碰撞、沉降和扩散，粒子的粒径、形态和密度是决定粒子沉积的重要因素[9-10]。雾化颗粒直径对药物沉积位置有直接影响，有效雾化颗粒直径应在0.5～10 μm。其中粒径5～10 μm的雾粒主要沉积于口咽部，粒径3～5 μm的雾粒主要沉积于肺部，粒径1～3 μm的雾粒50%～60%沉积于肺泡，而粒径＜1 μm的微粒吸入肺内后大部分又随气流呼出。综上，粒径1～5 μm的粒子在肺部沉降率最高，一般被选作雾化吸入制剂的主要组成部分，能够发挥最大的临床疗效[11-13]。

空气动力学粒径分布（APSD）可反映已形成的药物雾滴在人体肺部环境中的粒径分布情况，有利于评估吸入药物在临床应用中的安全性及有效性；可确定雾粒进入口腔并能到达肺部的粒子比例，还预测粒子在肺部发生沉积的位点。APSD的主要指标有FPD（微细粒子剂量）、FPF（微细粒子分数）、MMAD（空气动力学质量中直径）和GSD（几何标准偏差）。FPD为空气动力学粒径小于5 μm的气溶胶药物粒子的质量，描述了可能进入肺部的药物粒子的质量。FPF通常指药物在肺部沉积百分比。MMAD是指大于和小于该空气动力学直径的粒子质量各占总质量的一半，是衡量“平均”粒径的有效工具。GSD为累积分布低于84.1%和15.9%粒子的空气动力学直径（μm）比值，理想气溶胶的GSD值为1，但大多数药物的气溶胶是非均相的，GSD值一般在1.5～2.5[8]。本研究选用的5种射流雾化器均能产生MMAD≤5 μm的雾化效果。

目前，上市的空气射流雾化器品种众多，本研究选择了目前市场上常用的5种品牌或型号压缩空气式雾化器对银黄吸入溶液的递送速率、递送总量和APSD进行测定，综合各项评价指标可知，不同雾化器的体外雾化特性有显著差异，可能是由于不同雾化器所配备的压缩机功率不同及雾化杯的构造不同造成。如雾化器E配套的雾化杯无上盖，雾化过程有雾粒喷出，导致递送总量和呼出总量值偏低；雾化器A和雾化器B为采用同一压缩机，只是位于雾化杯内部的内芯不同，体外雾化特性也有明显差异，雾化器A的APSD各项指标均优于雾化器B，但递送速率、递送总量均小于雾化器B。综合比较递送速率、递送总量和APSD等指标测评结果，雾化器B和雾化器C的有效微细粒子沉积较多，粒径分布较窄，递送速率和递送总量较大，适合银黄吸入溶液的临床使用。

另外，本实验仅对同一种类型的雾化器进行了考察，发现采用同一种模型药物得出的结果有显著性差异，因此建议在雾化吸入制剂研发过程中，应考虑到不同类型、品牌、型号雾化器对雾化性能效果的影响，对拟选用的雾化器进行全面性能考察，以确保雾化吸入制剂临床使用的疗效。