赵瑞亭 邢国平 于海宁 范凌燕 潘瑞 李红芳 杨彬 杜业亮

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是各种卒中引起的脑功能障碍综合征，作为第二常见痴呆类型，其病程呈慢性阶梯式进展[1]，老年人群中发病居多,严重危害人类健康，故而找到其预防和治疗方法迫在眉睫，目前认为其治疗原则体现在治疗血管疾病原发病、对症促进智能恢复等，但方案尚未统一规范[2]，同时，笔者发现治疗上亦缺乏让人满意的药物，国内关于依达拉奉右莰醇的研究多集中在治疗急性脑血管病方面，尚无该药治疗VD的实验研究。为探讨依达拉奉右坎醇治疗VD的疗效及作用机制，我们观察该药干预VD大鼠后的行为表现及脑组织海马区Caspase-3、Aβ蛋白的表达，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SPF级SD大鼠30只，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证编号SCXK(鲁)20190003；体重(275±25 g)，据实验动物饲养和使用指南，动物养在潍坊医学院动物实验中心[温度(22±1)℃，相对湿度(55±5)%、12 h明暗循环]不限饮食，适应性饲养7 d。

1.2 主要实验试剂及器材 依达拉奉右莰醇(先声药业有限公司)、Aβ蛋白抗体(北京奥博森生物技术有限公司)、Caspase-3抗体(武汉赛维尔生物科技有限公司)、组化试剂盒 DAB 显色剂(Servicebio)、水迷宫实验用具及smart3.0分析系统(潍坊医学院实验动物中心)、显微镜(Nikon)；成像系统(日本尼康)；Image pro plus6.0(Media Cybemetics)。

1.3 模型制备 该实验采用双侧颈总动脉永久结扎术(2VO)法制备VD大鼠模型。操作对象术前12 h禁饮食。称重，腹腔注射10%水合氯醛溶液(4 ml/kg)麻醉，成功后颈前去毛，手术台上予以仰卧固定，固定牙齿防止舌后坠窒息。碘伏消毒，颈前正中作约2 cm纵行切口，钝性分离组织，找到并用2根手术缝合线分别结扎双侧颈总动脉，两线间距3 mm左右，术中一定注意不要过过分牵拉血管、不要结扎上迷走神经、操作时不要压住气管，注意保护肌肉，操作完毕后，逐层间断缝合伤口，对照组仅做颈前切口，钝性分离不结扎动脉，然后缝合。术后创处涂抹庆大霉素抗炎。整个实验在手术操作台进行，灯泡照射防止出现低温脑保护。待大鼠完全清醒后予以单笼饲养(注意保暖，充分的水和鼠粮，温湿度适宜)。

1.4 入选标准及干预 术后1周行Morris水迷宫实验，参考值为对照组大鼠平均逃避潜伏期，造模大鼠与参考值差值占该鼠逃避潜伏期比值>20%为痴呆鼠，将符合标准的大鼠纳入实验分组，剔除不符者并随机补充，最终入组的大鼠共30只，每组10只。治疗组：给予3.8 ml/kg配有0.9%氯化钠溶液的依达拉奉右莰醇(1.25 mg/kg依达拉奉右莰醇)于每12 小时注射1次，对照组及模型组则用同样方法等量0.9%氯化纳溶液，治疗14 d。

1.5 Morris水迷宫实验 治疗结束后行Morris水迷宫试验，前5 d定位航行实验，大鼠依次从4个象限面向池壁入水，以2 min内找到并停留站台4 s的耗时平均值为逃避潜伏期体现大鼠的学习能力,2 min内找不到站台则木棍引导至站台10 s充分熟悉环境以后放回，数值记为120 s。第6天进行空间探索实验，撤去站台，同样方法使大鼠入水后，自由游动记录2 min内经过站台的次数，即穿台次数，以便评估大鼠的记忆能力。

1.6 标本的采集及处理 跑完水迷宫后，给予麻醉、快速断头取出脑放入4%多聚甲醛内浸泡。石蜡切片并制成玻片行免疫组化(严格按照试剂盒说明操作)染色后于显微镜镜下观察并图像采集分析。

1.7 观察指标 比较第5天的逃避潜伏期均值、第6天穿台次数作为大鼠行为学表现水平，光镜下观察大鼠脑组织染色后相关指标表达情况。经NIKON digital sight DS-FI2成像系统采集图像，每个切片400倍视野下海马区随机拍摄3张图，Image-Pro Plus 6.0软件分别测定计算图像的AOD值，AOD=待测组织的积分光密度(IOD)/阳性面积，3张图取平均值作为该鼠的AOD，即为目的蛋白(Caspase-3、Aβ蛋白)的相对表达量。

2 结果

2.1 Caspase-3、Aβ的AOD值 3组之间采用方差分析比较，其中2组组间比较采用LSD-t检验。模型组Aβ蛋白AOD值与治疗组和对照组相比明显增加，治疗组与对照组相比增加，Caspase-3模型组AOD值与治疗组和对照组(0.036±0.001)相比明显增加，治疗组与对照组相比增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1，2。

表1 3组大鼠Aβ、Caspase-3平均光密度值(IOD/Area)比较

图1 Aβ在大鼠海马组织的阳性表达Aβ(免疫组化×400)

图2 Caspase-3在大鼠海马组织的阳性表达(免疫组化×400)

2.2 3组大鼠逃避潜伏期均值及穿台次数的比较 3组大鼠第1～5天的逃避潜伏期，随着训练时间的延长，其逃避潜伏期均值逐渐的缩短，第5天模型组平均逃避潜伏期与治疗组和对照组比较明显延长，治疗组与对照组比较平均逃避潜伏期明显延长，差异均有统计学意义(P<0.05)。3组大鼠之间的穿台次数比较采用秩和检验，其中模型组2 min内穿台次数与治疗组和对照组比较明显减少，治疗组与对照组比较，穿台次数明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠逃避潜伏期均值及穿台次数比较

3 讨论

目前关于VD发病机制可能与氧化应激和炎症等有关[3]，脑缺血损伤可涉及自由基、炎性反应和细胞凋亡等病理生理机制[4]，高脂血症、脑动脉硬化等可使脑组织低灌流、神经元缺氧，脑内高葡萄糖聚集，但氧水平不足，糖酵解发生增加，产物自由基、乳酸随之聚集，脑代谢低的同时思维延缓，从而影响认知，最终形成VD[2]。本实验用2VO法使鼠脑缺血缺氧制造VD模型，机制科学可循。作为目前唯一可早期治疗改善症状、预后的一种痴呆病，其主要以清除自由基和抗缺血缺氧、疏通血管、改善血液稀释度为治疗关键[1]。为此，本实验选用具有相关功效的依达拉奉右莰醇作为治疗药物。

β-淀粉样蛋白是一种多肽，神经毒性强，在认知能力下降的患者中通过使神经传导受到干扰，影响神经可塑性、使神经变性[5]。2VO导致的慢性低灌注会使Aβ生成增加、清除减少[6]，Aβ沉积不正常时可使神经细胞凋亡坏死[7]。素有细胞凋亡执行者之称的Caspase-3，其激活分2步，通过形成p17/p12形式的酶诱导细胞凋亡[8]。二者主要作为海马区凋亡水平的常用指标。海马区主管记忆、认知等，且对缺血缺氧较为敏感，因此本实验选取以上2种指标反应实验中大鼠海马区凋亡的表达水平。

依达拉奉右莰醇，是具有神经保护功效的新药，其中的两种活性成分：依达拉奉与右旋莰醇各占比例分别为0.75、0.25，拥有氧自由基清除、脑水肿缓解、神经元延迟死亡[4,9]、缺血改善功效的依达拉奉，右莰醇分子量小、亲脂性好的特性使得该药半数以上可高效穿透血脑屏障，与盐水配伍使用，可阻碍神经元糖酵解过程，清除乳酸，此外脂质过氧化的抑制需要清除羟自由基，该药亦参与其中，该药还可刺激前列腺素生成，改善脑血流[3]，此外能下调(次)黄嘌呤氧化酶活性以抑制迟发性神经元凋亡、保护神经，延缓病情进展[10],右莰醇是一种食品添加剂、由96%以上的冰片组成，冰片作为一种天然存在的双环单萜类化合物[4]，发现其可抑制炎性因子的产生并保护脑，右莰醇显示出通过多种分子途径抑制炎症过程和Caspase相关的细胞凋亡。它的高渗透性可以帮助其他药物轻易地渗透到血脑屏障，从而更有效地发挥作用。可以通过多功能的细胞保护途径来防止缺血性脑损伤[9,11]，其在动物缺血性模型中的抗炎作用,体现在抑制肿瘤坏死因子-α、白介素-1β、环氧化酶-2和诱导一氧化氮合成酶(iNOS)等炎症相关蛋白的产生或表达，并降低了缺血大脑中的过氧亚硝酸阴离子(一种性质活泼的自由基，有强氧化损伤毒性、脂质过氧化和DNA损伤的作用)水平，其在大多数的组织中迅速分布，与依达拉奉协同使自由基和炎症的破坏作用被打破[4,11,12]。

本实验所有样本免疫组化染色后均有不同程度的显色，因阳性面积深浅不同，综合考虑Aβ、Caspase-3表达部位、可操作性等因素后故而选用AOD作为检验目的蛋白表达水平的方法更为合适。本实验造模之后的VD大鼠海马区Aβ AOD值(0.157±0.008)，明显高于对照组的(0.039±0.001)。同样对照组大鼠Caspase-3 AOD值(0.036±0.001)，穿台次数5(4.75,6)逃避潜伏期(28.95±2.65)s，而模型组大鼠Caspase-3AOD均值则为(0.141±0.002)，穿台次数2(1，2)，避潜伏期(48.01±2.84)s，由此可见，相较于对照组，模型组凋亡相关蛋白的AOD值增加，且延长的逃避潜伏期、减少的穿台次数显而易见，提示慢性缺血可能导致VD大鼠海马区脑组织发生凋亡，最终导致大鼠行为学表现差，记忆及学习能力减退。治疗后VD大鼠穿台次数由2(1,2)增加至3.5(3,4)，逃避潜伏期缩短由(48.01±2.84)s缩短至(36.56±2.86)s，海马区的Aβ/Caspase-3 AOD值由模型组(0.157±0.00/0.141±0.002)下降至(0.082±0.002/0.076±0.002)，反应出治疗后VD大鼠海马区凋亡蛋白的表达明显受到抑制，提示依达拉奉右莰醇内的2种活性成分协同在自由基的清除、炎症的抑制以及血脑屏障的保护等方面发挥优质效果，能明显遏制尤其由缺血性脑卒中引起的脑损害，发挥可观的神经保护作用。证明依达拉奉右莰醇的治疗，可能减少海马区脑组织凋亡发生，使大鼠学习记忆能力有所恢复。

综上所述，依达拉奉右莰醇可能通过下调海马神经元凋亡的相关蛋白表达来改善VD大鼠的学习能力、记忆能力。