熊文涛，罗世友，沈雨民，熊焕金，吴小燕，肖叶青，陈明亮*

（1.江西省农业科学院 水稻研究所，江西 南昌 330200；2.水稻国家工程研究中心(南昌)/国家水稻改良中心 南昌分中心，江西 南昌330200）

【研究意义】水稻是世界主要的粮食作物之一，是半数人口的主粮。低温冷害是水稻常见的气象灾害。在我国高纬度高海拔地区，在双季稻区早稻的倒春寒和晚稻的寒露风，均有不同程度的低温冷害，严重影响了水稻的生长发育[1]。在低温胁迫下，水稻会产生一系列的生理代谢变化的应激反应，包括叶绿素含量的改变，植物内源激素ABA 和GA 的改变，丙二醛、蔗糖、脯氨酸等代谢的积累等[2-3]。【前人研究进展】水稻耐冷性也是由多种不同分子机制协调产生，是复杂的数量性状（QTLs）。对水稻低温胁迫分子生物学研究的逐步深入，定位及克隆的水稻耐冷相关遗传位点和基因越来越多见报道[4-6]。GSZ2，编码马来酰乙酰乙酸异构酶，第99位的苯丙氨酸的变异会导致酶活的下降，降低水稻耐冷性[7]。COLD1，编码一个G 蛋白调节因子，在低温响应时与G 蛋白α 亚基RGA1 互作激活钙通路，提高水稻耐冷性[8]。bZIP73，编码一个bZIP 转录因子，通过与bZIP71 互作调节脱落酸水平和活性氧平衡，提高水稻耐冷性[9]。Os-CNGC9，编码环核苷酸离子通道蛋白，低温下诱导的钙内流，提高胞质钙含量，增强水稻的耐冷性[10]。HAN1，编码细胞色素P450 家族的单加氧化酶，在MYB 转录因子的影响下调控茉莉酸介导的低温响应，是耐寒性的负调控因子[11]。【本研究切入点】东乡野生稻（简称东野）被证明是具有较强耐冷性的水稻资源，目前已经从中定位克隆了一些耐冷遗传位点，但水稻耐冷性的分子调节机制较为复杂，还有大量相关研究需要进一步开展。【拟解决的关键问题】前期研究从以东野为供体、赣香B 为受体的片段代换系中筛选获得强耐冷株系IL732。通过对赣香B 和强耐冷株系IL732 冷胁迫处理前后进行表达谱重测序，分析冷胁迫处理前后基因表达谱差异，通过生物信息学手段从中获得多个耐冷相关候选基因[12]。其中LOC_Os11g19840，编码一个类黄酮O-甲基转移酶类似蛋白，命名为OsOMTL1（O-Methyltransferase like 1），进行功能验证。

1 材料与方法

1.1 试验材料

赣香B 和以赣香B 为轮回亲本，东野为供体亲本的耐冷片段代换系IL732 为本研究室所有；OsOMTL1序列克隆自耐冷株系IL732，OsOMTL1的过表达载体构建、赣香B的转化再生和阳性筛选方法同熊文涛等P[13]转化OsHI-XI。赣香B过表达OsOMTL1基因T1代阳性植株用于后续试验。

1.2 耐冷筛选

各水稻株系苗置于三洋MGC-450BP光照培养箱28 ℃恒温培养至近3叶1心期时，放在常温下3 d进行炼苗，在澳柯玛YC-370 医用冷藏箱（8±1）℃低温下处理3 d，随后将试验材料置于常温条件下使其恢复生长。7 d后统计各株系的存活苗数。以幼苗存活率=存活苗数/处理前秧苗数×100%作为苗期耐冷性的评价指标，筛选耐冷株系。

1.3 基因表达分析

赣香B和耐冷株系IL732培养至近3叶1心期时，放在常温下3 d进行炼苗，（8±1）℃低温下处理3 d，取处理前和处理后的叶片进行定量PCR 分析，以赣香B 常温表达量为参照计算相对表达量；取IL732 常温下3 叶1 心期不同部位根、茎、叶，以根部表达量为参照计算相对表达量；取赣香B 和转基因过表达株系常温下3 叶1 心期叶片，以赣香B 常温为参照计算相对表达量。定量PCR 引物为OsActin-F：5'-CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA-3'；OsActin-R：5'-CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3'；OsOMTL1-F：5'-CGCAAAGATGGAGGGAAGGT-3'，OsOMTL1-R：5'-GCCAGTCATTTTCGTCTCGC-3'；每个样品检测3次重复，每次随机取5棵苗进行混样。

1.4 亚细胞定位

以耐冷株系IL732 cDNA 为模板扩增OsOMTL1，前引物：5'-CTAGTCTTAAGTCCGGAGCTAGCTC TAGAATGGCAGGTCAGGCTCCCAA-3'；后引物：5'-CTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGATCCCGGATAGA CCTCAAAGACAGCT-3'，获得目的片段用XbaI 与BamHI 双酶切与瞬时表达载体PAN580-GFP 进行重组，PCR测序验证后挑选阳性克隆，与核标记质粒共转化水稻原生质体，弱光下培养8～10 h后，在激光共聚焦显微镜下观察亚细胞定位。

1.5 基因分型作图

登录RiceVarmap 网站（http://ricevarmap2.ncpgr.cn），对OsOMTL1（LOC_Os11g19840）进行SNP 分析，挑选其中具有非同义变异SNP对RiceVarmap网站中总计4 692份水稻种质材料进行单倍体分析作图。

2 结果与分析

2.1 转基因耐冷性验证

赣香B 和转基因过表达OsOMTL1赣香的T1种子均发芽正常，但从叶片伸出开始，过表达OsOMTL1株系生物量显著低于赣香B，生长受到抑制（图1A）；表达量分析表明过表达株系中OsOMTL1的表达量远远高于赣香B（图1B）；苗期冷胁迫处理后，赣香B存活率为0%，而过表达OsOMTL1赣香株系存活率为26.3%，过表达株系耐冷性显著强于赣香B（图1C）。

图1 过表达OsOMTL1植株耐冷鉴定Fig.1 Identification of cold tolerance of rice lines with overexpressing OsOMTL1

2.2 基因表达分析

对OsOMTL1进行表达分析研究，该基因在3 d 低温处理后表达量显著上升，在耐冷株系IL732 中表达量常温和低温均显著高于赣香B（图2A）；该基因主要在叶片中表达，根部和茎里表达较低（图2B）。原生质体亚细胞定位表明该基因编码蛋白存在于细胞质中（图2C）。

图2 OsOMTL1表达模式研究Fig.2 Expression pattern of OsOMTL1

2.3 基因单倍型分析

通过OsOMTL1基因编码区7 个非同义变异SNP 对RiceVarmap 网站中4 692 份水稻种质材料进行分析，OsOMTL1可以分为5 个基因单倍型，其中以I 型和II 型为主，存在明显的籼粳分化（表1）。水稻亚种的分型分布表明粳稻主要在I 类单倍型中，而籼稻和Aus稻主要在II 和III 类单倍型中，IV 和V 类单倍型是稀有的类型（图3）。序列检测结果表明耐冷株系IL732 中OsOMTL1为I 类单倍型，与日本晴中该基因序列相同，而对照材料赣香B为II类单倍型。

图3 不用水稻亚种OsOMTL1分型分布Fig.3 Genotyping distribution of OsOMTL1 with rice subspecies

表1 OsOMTL1基因单倍型分析Tab.1 Haplotype analysis of OsOMTL1

3 结论与讨论

水稻耐冷性是受多种分子机制共同调节的复杂性状。保持叶绿体活力、维持电解质平衡、提高抗氧化能力、积累可溶性小分子物质、调节植物激素脱落酸和赤霉素含量等，都有助于提高水稻的耐冷性。其中，提高抗氧化能力是水稻对于低温胁迫的重要防御机制。水稻在遭遇低温胁迫时，细胞内氧代谢平衡失调，会产生大量的活性氧自由基，造成细胞伤害。水稻通过产生各种抗氧化酶（超氧歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT 等）和抗氧化剂（谷胱甘肽GSH、抗坏血酸AsA 等），清除活性氧自由基，保护细胞和组织[2,4]。类黄酮物质是植物体内重要的次生代谢物，具有较强的抗氧化能力，可以提高植物对于多种逆境胁迫的抗性，包括紫外线辐射、干旱胁迫、土壤铝毒、生物病害等[14-16]。在低温胁迫下，多种植物会积累类黄酮物质，提高耐冷性[17-18]。拟南芥中过表达类黄酮代谢途径中的黄酮醇合成酶FLS会促进植株内类黄酮物质的积累，增强对于多种逆境胁迫的抗性[19]。本研究中通过低温胁迫基因表达谱差异筛选克隆了来自东稻的冷诱导表达基因OsOMTL1，编码一个类黄酮O-甲基转移酶类似蛋白，可能参与了类黄酮物质的合成。该基因在水稻耐冷株系IL732中表达量显著高于冷敏感材料赣香B，且受到低温诱导上调表达。该基因过表达水稻植株的苗期耐冷性显著提高。有研究表明包括OsOMTL1在内一些类黄酮类物质相关代谢基因参与了水稻对于紫外辅射的响应，表达量上调，促进了类黄酮物质的积累[20]。OsOMTL1可能通过参与水稻体内类黄酮类物质的代谢，增强了水稻植株的耐冷性。

植物生长和抗逆反应中存在着复杂的调控机理，有研究表明植物逆境胁迫响应反应中类黄酮物质的合成对于植物生长具有抑制作用。BES1是拟南芥中油菜素甾体（BR）信号途径上的关键转录因子。正常环境下BR激活BES1，与多个MYB转录因子启动子结合抑制它们的表达量，降低类黄酮物质的生物合成，促进植株生长；当逆境胁迫出现时，BES1的表达受到抑制，MYB转录因子表达量上升，促进类黄酮类物质积累，抗逆性增强，但植株生长受到显著抑制[21]。当木质素合成关键酶羟基肉桂酰基转移酶HCT基因被沉默后，在严重抑制植物生长的同时会大量积累类黄酮物质[22]。本研究表明，超表达OsOMTL1植株苗期虽然显著提高了耐冷性，但生长势在正常条件下明显弱于对照，可能与类黄酮类物质合成和植物生长之间的复杂调控机制有关。

在长期生长环境筛选中，粳稻的耐冷性显著强于籼稻。虽然目前已克隆水稻耐冷基因的分子机理有很大不同，但大多数基因核酸序列均存在典型的籼粳分型，且来自粳稻的基因型可以显著提高耐冷性，如COLD1、HAN1、CTB4a等[8,11,23-24]。本研究中也存在类似的结果，OsOMTL1存在显著的籼粳分型，克隆自耐冷株系IL732（来自东稻）的OsOMTL1属于粳稻基因型，而对照冷敏感材料赣香B 属于籼稻基因型。未来通过籼粳稻杂交、复交，人工低温高压筛选将粳稻中的耐冷种质导入籼稻，是培育长江中下游稻作区耐冷水稻的有效途径。

致谢：江西省农业科学院博士启动项目（20181CBS004）同时对本研究给予了资助，谨致谢意！