姜云婷， 王波， 王荟洁， 付艳鸿， 王洪洋， 吴相华

(1.云南师范大学 云南省马铃薯生物学重点实验室，云南 昆明 650500；2.云南师范大学 化学化工学院，云南 昆明 650500)

马铃薯晚疫病是由卵菌纲致病疫霉菌(Phytophorainfestans)引起的一种具有毁灭性的病害.全球每年因晚疫病造成的损失多达几十亿美元，严重影响马铃薯的产业发展[1].目前，在世界范围内马铃薯晚疫病的防治主要是使用化学药剂.但由于化学药剂选择不够科学，长期使用一种或同类药剂，导致晚疫病菌产生了一定抗药性[2].因此，筛选与现有马铃薯晚疫病防治药剂无交互抗性的新型杀菌剂，合理交替使用具有不同靶标位点的高效、低毒杀菌剂，对防控马铃薯晚疫病具有重要意义.

1,8-萘酰亚胺衍生物具有光化学稳定和强荧光量子效率等特点，在光电敏感材料、液晶材料、太阳能收集材料、激光染料、光诱导DNA切断剂、DNA嵌入剂以及化学荧光探针等高技术领域均有应用[3-5].近几年，研究表明1,8-萘酰亚胺类衍生物存在抗肿瘤和抗菌等特性，具有良好的医学应用前景[6-7].2015年，田广轩等[8]利用活性结构拼接和生物电子等排原理，将1,8-萘酰亚胺与二硫代氨基甲酸酯拼接合成新型1,8-萘酰亚胺类衍生物，通过筛选部分衍生物表现出高效抗菌和抑制肿瘤细胞生长的特性.为了探究此类物质是否对晚疫病菌有抑制作用，研究利用离体叶片接种鉴定法，对1,8-萘酰亚胺类衍生物进行晚疫病菌毒力测定.以期为马铃薯晚疫病的化学防控提供新型药剂，同时为综合防治晚疫病理论研究提供一定的数据支撑.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

致病疫霉菌菌株88069，由华中农业大学马铃薯课题组馈赠.

1.1.2 供试培养基

黑麦固体培养基(1 L为例)：取60 g黑麦加300 mL水，50 ℃浸泡过夜后收集浸出液体，依次加入100 mL V8蔬菜汁、20 g蔗糖、0.2 g CaCO3和15 g琼脂，调整pH至6.8，121 ℃灭菌20 min.用于马铃薯晚疫病菌的培养、常规保存以及室内毒力测定.

1.1.3 供试马铃薯品种

离体叶片接种材料为感病马铃薯品种Désirée，由云南师范大学马铃薯科学研究院保存.

1.1.4 供试药剂

阳性对照(+ck)为克露(72%霜脲·锰锌)：含8%霜脲氰和64%代森锰锌，购自上海杜邦农化有限公司.阴性对照(-ck)为0.1%的二甲基亚砜(DMSO)，购自国药集团化学试剂有限公司.13种供试1,8-萘酰亚胺类衍生物由云南师范大学化学化工学院提供，详情如表1.

表1 13种供试1,8-萘酰亚胺类衍生物

1.2 试验方法

1.2.1 室内毒力鉴定

采用菌丝生长速率法测定13种1,8-萘酰亚胺类衍生物对马铃薯晚疫病菌的室内毒力.首先进行初筛，统一将13种衍生物按40 μg/mL浓度配置黑麦固体培养基，每种衍生物倒6个培养皿.用灭菌后的打孔器(直径5 mm)在预培养8 d的晚疫病菌落边缘均匀取菌饼，正面朝下接种到不同处理的黑麦固体培养基上.20 ℃恒温培养8 d后，用十字交叉法测量菌落直径，取其平均数作为各处理组的菌落直径.计算菌落的净生长量和抑制率.根据供试药剂浓度与菌丝生长抑制率的关系，计算供试药剂浓度对数与抑制率概率值间的毒力回归方程(y=bx+a)，通过其回归方程计算杀菌剂的抑制中浓度值(EC50)[9].菌落的净生长量=菌落测量直径-接种菌饼直径(5 mm).生长抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照组菌落直径-菌饼直径)×100%.

1.2.2 接种鉴定

参照王洪洋等[10]的研究方法.将晚疫病菌的孢子囊浓度调至约5×104个/mL，4 ℃下放置 2～3 h 后，用于接种.采用离体叶片接种方式接种马铃薯栽培种Désirée.选取自顶叶以下第 3～5复叶上的单叶用于接种鉴定，每个单叶两边各接种 10 μL 孢子悬浮液，塑料薄膜封口接种盘，保持空气湿度 95%左右，温度 20 ℃左右.接种后 5 d，分别在自然光和紫外光下拍照.

1.2.3 试验数据分析

数据采用SPSS Statistics 16.0版数据分析软件进行处理分析.利用Duncan's新复极差测验法进行差异显著性分析.

2 结果与分析

2.1 13种供试1,8-萘酰亚胺类衍生物对晚疫病菌抑菌效果

从图1可以看出，在40 μg/mL浓度条件下，3a、3b、3c和3d这4种1,8-萘酰亚胺类衍生物对菌丝生长产生了不同程度抑制，其余1,8-萘酰亚胺类衍生物均不能有效抑制晚疫病菌菌丝生长.

2.2 4种衍生物对晚疫病菌的抑制中浓度

从图2和表2可看出，不同浓度下3a、3b、3c和3d 4种衍生物对马铃薯晚疫病菌的毒力有明显差异，特别是3c，在40 μg/mL浓度条件下的抑菌效果比阳性对照克露好.从表3可以看出3c的EC50为16.55 μg/mL，毒力最强且优于阳性对照；毒力强度随后依次是3b、3a和3d，其EC50分别是26.71、27.06 μg/mL 和29.25 μg/mL.

表2 不同浓度下4种衍生物对晚疫病菌的抑制作用

表3 4种衍生物的毒力比较

2.3 衍生物3c对晚疫病菌的防控效果

为了鉴定衍生物3c能否有效防控马铃薯晚疫病，采用20 μg/mL浓度的3c喷施处理盆栽马铃薯品种Désirée叶片，24 h后进行离体叶片接种晚疫病菌菌株88069，接种5 d后观察发病情况.如图3所示，阴性对照(喷施含0.1% DMSO)叶片形成明显晚疫病斑(黄色圈)，但是阳性对照(20 μg/mL克露)和喷施衍生物3c的叶片没有明显病斑产生.说明衍生物3c可以对叶片晚疫病发生起到较好的防控效果.

3 讨论

目前，生产上对马铃薯晚疫病的防控仍以化学防控为主要手段.然而现有的化学防治药剂大多具有高度选择性和作用靶点单一等问题，快速变异的晚疫病菌易对其产生抗药性.另外，不合理的农药使用，如长期连续使用一种或者一类农药，不仅会造成农药残留超标或药害的出现，还对环境造成了污染[11-13].因此，研发多位点作用的绿色安全、毒性低且不易产生抗药性的药剂是未来防治马铃薯晚疫病急需解决的关键问题.

研究对人工合成的13种1,8-萘酰亚胺衍生物杀菌剂的马铃薯晚疫病菌室内毒力进行测定，筛选出1,8-萘酰亚胺4-位吗啉取代三氮唑二硫代氨基甲酸酯衍生物3c具有良好的抑菌效果，其EC50值比商用化学药剂克露还要小，说明其对晚疫病菌的毒力很强.在马铃薯晚疫病菌室内毒力试验的基础上，通过离体叶片接种鉴定，发现衍生物3c可以有效抑制晚疫病菌在叶片上的生长，这与室内毒力测定结果一致.

马铃薯在生长过程中，会遭遇各种各样病害.已有研究表明1,8-萘酰亚胺4-位吗啉取代三氮唑二硫代氨基甲酸酯衍生物3c对枯草芽孢杆菌有明显的抗菌效果，显示出该衍生物具有深入研究的价值和潜在的应用前景[8].建议下一步验证衍生物3c是否对马铃薯早疫病、青枯病和黑痣病等病原菌具有抗菌活性，扩大其作用范围.同时，合理规划衍生物3c与其他晚疫病防控药剂交替使用，以降低产生抗药性的风险.

综上所述，1,8-萘酰亚胺4-位吗啉取代三氮唑二硫代氨基甲酸酯衍生物3c对马铃薯晚疫病菌有较强的毒力，能有效防控晚疫病菌侵染.