龚远博，胡吉怀，胡丁猛，许景伟，王延平*

(1 山东农业大学 林学院，山东泰安 270018；2 山东省林业科学研究院，济南 250014)

盐碱胁迫是农林业生产面临的最严重的环境问题之一。中国盐碱土壤面积达9. 9 × 107hm2，是世界上盐碱土分布面积最大的三个地区之一[1]。当前，国家对盐碱地综合利用高度重视，通过实施生物技术手段提升植物对盐碱的适应性和耐受能力，已成为盐碱地综合开发利用中经济且有效的技术措施[2]。

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhiza fungi, AMF)是陆地生态系统中分布最广的一类共生真菌[3]，广泛分布于各种土壤生境之中[4]。AMF没有严格的宿主专一性，可以与约80%陆生植物的根系形成互惠共生体[5-6]，其能够从宿主植物中获取碳源，并通过庞大的根外菌丝网络，帮助植物从土壤中吸收营养元素，增加渗透调节物质的积累，减少宿主对盐份的摄入，改善离子平衡，进而提高植物的耐盐能力并促进植物生长[7-9]。因此，通过接种AMF来提高植物的耐盐能力成为盐碱地综合治理领域的研究热点。

杜梨(PyrusbetulifoliaBunge)，隶属于蔷薇科(Rosaceae)梨属(PyrusL.)，地理分布范围广泛。在经济林栽培中，杜梨常作为梨栽培品种的砧木[10]；另其全株可入药[11]，木材致密光滑[12]，也具有很高的开发利用价值。此外，杜梨还具有一定程度的耐干旱瘠薄、耐涝、耐盐碱能力，在困难立地综合治理中也发挥着特殊作用[13]。进一步提高杜梨对盐碱胁迫的耐受性，能够使其在盐碱地综合治理中发挥更大的经济与生态价值。

当前，关于单盐[14]和单碱[15]胁迫下梨属植物的生长特征已有不少研究，然而自然界中的盐碱成分组成复杂，混合盐碱胁迫是黄河三角洲土壤逆境的重要特征。另外，杜梨菌根化后的光合生理特征研究较少，尚不能很好地揭示接种AMF对杜梨耐盐碱能力提升的生理生态机制。鉴于此，本试验以杜梨实生苗作为试验材料，根据滨海盐碱地盐碱组成设置盐碱胁迫处理[16]，通过分析菌根化杜梨幼苗的生长、生理与光合作用等指标，明确接种AMF提升杜梨耐盐碱能力的生理机制，为进一步提升杜梨对盐碱环境的适应性以及苗木菌根化技术研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试杜梨种子来源于山东省临沂市河东区。2021年4月中旬，将经催芽处理的种子播种于灭菌基质中。待幼苗长出4片真叶，选取生长势基本一致的幼苗移栽至口径9.5 cm、深8.5 cm花盆中，花盆内预先填装140 g消毒基质(经过121 ℃高温湿热灭菌2 h，草炭土、珍珠岩、蛭石按照体积比5∶1∶3混合)，每盆1株，并将盆栽幼苗置于遮雨棚中进行培养。本研究在黄河三角洲杜梨人工林土壤丛枝菌根真菌类群及分布特征分析的基础上，确定将根际土壤丰度较高的根内根孢囊霉(Rhizophagusintraradices，Ri)作为试验菌种，相关菌株(BGC BJ09)从北京市农林科学院植物营养与资源研究所购买。

1.2 试验设计

试验设置丛枝菌根真菌和盐碱胁迫2个因素。接菌因素包括接菌(AM)和不接菌(NAM)2种处理。杜梨苗移栽入盆的同时进行接种，AM组每盆施加10 g菌剂(约300个孢子)在根系周围，与根系直接接触。NAM组施加灭活的10 g菌剂，其余操作相同。各处理之间进行相同的管理方式，待缓苗45 d后，同时进行混合盐碱胁迫。盐碱组成按照前人测定的滨海盐碱地盐分含量换算得到(NaCl∶NaSO4∶NaHCO3摩尔比为26∶65∶9)[16]，盐碱胁迫因素设置6个水平处理(0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 g·kg-1)，各盐碱溶液pH范围均处于8～8.7。其中，0 g·kg-1为对照组，1.5 g·kg-1为低盐碱组，3.0 g·kg-1和4.5 g·kg-1中盐碱组，6.0 g·kg-1和7.5 g·kg-1为高盐碱组。

本试验共设置接种、盐碱处理组合12(2×6)个，每个处理组合10个重复(盆)，共120盆。为了使盐分能够在营养钵中均匀分布，在施加混合盐碱前3 d停止浇水。将所需盐分溶解于100 mL自来水，均匀浇灌到基质中进行饱和灌溉，将漏到托盘中的水再倒回各自营养钵。为了避免盐的冲击效应，混合盐碱按照每天3 g·kg-1梯度递增，达到预期各浓度为止。之后每2 d浇水100 mL。盐碱胁迫处理的幼苗连续培养30 d后进行菌根侵染率、光合作用及其余各项生长和生理指标的测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 菌根侵染率盐碱胁迫30 d后，将每个处理中10株植物全部取出，每株植物随机选取5条细根，每细根剪成1.0 cm长的根段，并按处理浓度将所有根段混合，随机选取100个根段作为样本，重复3次。采用曲利苯蓝染色法[17]测定根段侵染情况，在显微镜下观察菌根真菌的侵入点、菌丝形态、丛枝及泡囊分布等，并计算菌根侵染率。菌根侵染率=丛枝菌根真菌侵染的根段长度/测定根段的总长度×100%。

1.3.2 幼苗株高和生物量用卷尺分别测定杜梨幼苗在盐碱胁迫之初和胁迫30 d后的株高，并计算苗高生长量(胁迫终苗高-胁迫初苗高)。待胁迫结束后收获植株，并将植株分为地上部和地下部，带回实验室后先在烘箱中用105 ℃杀青30 min，随后用80 ℃烘至恒重，称量杜梨地上部和地下部的生物量。

1.3.3 叶片生理生化指标每盆采集杜梨叶片4片，所有处理均采集相同位置的叶片，并将同一处理的叶片混合后分成5份作为待测样品。采用95%乙醇浸提法测定光合色素含量、茚三酮显色法测定游离的脯氨酸(Pro)含量、硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)的含量、考马斯亮蓝G-250比色法测定可溶性蛋白(SP)含量、蒽酮比色法测定可溶性糖(SS)含量、NBT比色法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性、愈创木酚比色法测定过氧化物酶(POD)的活性、相对电导率法测定质膜透性(MRP)。具体方法参考文献[18]。

1.3.4 叶片光合气体交换参数和叶绿素荧光参数盐碱胁迫30 d后，每个处理随机选取5盆植株进行相关光合参数的活体测定。首先，于上午9:00-11:00，均选取植株第4片功能叶，使用LI-6800便携式光合仪(LI-COR Inc, USA)在饱和光强1 200 μmol·m-2·s-1，CO2浓度为400 μmol·mol-1、流速500 mL·min-1，叶室温度为28 ℃条件下测定叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)和胞间二氧化碳(Ci)等光合参数，每个处理重复测5次。此外，在同一处理中选取第5片功能叶，使用FMS-2型脉冲调制式叶绿素荧光仪，在光适应下测定最小荧光(Fo′)、最大荧光(Fm′)、可变荧光(Fv′)和稳态荧光(F′)，在经过30 min的暗适应后测定最大荧光(Fm)、初始荧光(Fo)和可变荧光(Fv)，然后计算实际光化学效率(ΦPSⅡ)、最大光化学效率(Fv/ Fm)、光化学猝灭系数(qp)和非光化学猝灭系数(NPQ)等荧光参数。具体测定方法参考Neil等[19]。

1.4 数据分析

所有图表数据表示为平均值±标准差。通过 Excel 2016对数据进行处理，SPSS 22进行单因素和双因素方差分析(Duncan)，Origin 9.0进行统计图的绘制。

2 结果与分析

2.1 盐碱胁迫对根内根孢囊霉侵染杜梨根系的影响

图1显示，丛枝菌根真菌根内根孢囊霉(Ri)对杜梨根系的侵染明显呈现泡囊、根内菌丝和根外菌丝结构。从表1可知，当盐碱浓度为0(对照)时，接种根内根孢囊霉的杜梨幼苗根系侵染率为83.69%；在盐碱浓度小于等于 4.5 g·kg-1时，Ri 的根系侵染率处于79.35%～83.69%之间，但各盐碱胁迫处理间及其与对照处理间的差异均不显著；当盐碱浓度大于4.5 g·kg-1后，Ri 的根系侵染率开始显著下降，6.0 g·kg-1和7.5 g·kg-1盐碱胁迫处理的根系侵染率分别下降至47.98%和32.97%。可见，根内根孢囊霉对杜梨根系的侵染能力在中低浓度盐碱胁迫下无显著变化，而在高浓度盐碱胁迫下显著下降。

2.2 盐碱胁迫下根内根孢囊霉对杜梨生长的影响

图2显示，随着盐碱胁迫程度的增加，接种Ri(AM)和不接种Ri(NAM)处理杜梨苗高(A)和地上、地下生物量(B)均呈现逐渐下降的趋势；在相同盐碱胁迫条件下，AM处理的苗高和生物量均不同程度地高于相应的NAM处理。其中，在盐碱浓度分别为0、1.5、3.0、6.0、7.5 g·kg-1时，接种Ri均显著或极显著提高了杜梨的苗高，尤其是在7.5 g·kg-1处理下苗高显著增加77.6%；除了3.0和4.5 g·kg-1浓度处理外，接种AMF也均显著或极显著提高了杜梨地上部与地下部分生物量。上述结果说明，接种Ri有利于提升杜梨幼苗对盐碱环境中的适应性，促进植株生长。

2.3 盐碱胁迫下接种根内根孢囊霉对杜梨叶片光合色素含量的影响

从图3可知，在不同的盐碱胁迫处理中，接种Ri均能够显著提高杜梨叶片叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量(图3,A、B、D)。比如，相较于NAM组，AM组杜梨叶片的叶绿素a含量在0～7.5 g·kg-1盐碱胁迫下分别显著提高了9.1%、25.6%、36.7%、8.1%、22.3%和46.0%等。同时，AM组杜梨叶片的类胡萝卜素含量仅在3.0 和7.5 g·kg-1盐碱胁迫下比NAM组显著提高，增幅分别为36%和17.4%(图3，C)。因此，接种Ri有利于盐碱胁迫下杜梨叶片光合色素的合成，从而有利于光合作用进行和生物量积累。

2.4 盐碱胁迫下接种根内根孢囊霉对杜梨叶片光合气体交换参数的影响

如图4所示，与NAM组相比，AM组杜梨叶片净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)均不同程度提高，而其胞间二氧化碳浓度(Ci)在0～3.0 g·kg-1盐碱胁迫时降低，在4.5～7.5 g·kg-1盐碱胁迫时升高，且升降幅度大多达到显著水平。首先，AM组的叶片Pn均比NAM组显著增加，只是在不同浓度盐碱胁迫下的涨幅不同，其中在盐碱浓度为3.0 和7.5 g·kg-1时的增幅最大，均超过30%(图4，A)。其次，随着盐碱胁迫程度的增加，杜梨幼苗叶片Tr呈现先升高后降低的趋势，但AM组在3.0～7.5 g·kg-1盐碱胁迫比相应NAM组显著提高了5.7%～264.3%(图4，B)。再次，接种AMF对杜梨叶片Gs产生的效应因盐碱浓度的不同而异，在未进行盐碱胁迫时显著低于NAM组，在1.5 g·kg-1时与NAM组无显著差异，在较高浓度盐碱胁迫(>3 g·kg-1)时极显著高于NAM组(图4，C)。此外，接种AMF对杜梨叶片Ci的调节作用受到盐碱浓度的影响，AM组的Ci在盐碱浓度小于3 g·kg-1时均不同程度低于NAM，在盐碱浓度大于4.5 g·kg-1时均高于NAM组，其在浓度为6.0和7.5 g·kg-1时增幅达到极显著水平(图4，D)。上述结果说明，接种Ri有利于在盐碱胁迫环境中提升杜梨幼苗叶片的光合效率。

2.5 盐碱胁迫下接种根内根孢囊霉对杜梨叶片叶绿素荧光参数的影响

在盐碱胁迫条件下，AM组杜梨的实际光化学效率均不同程度地高于NAM组，但增幅仅在盐碱浓度为1.5 g·kg-1和6 g·kg-1时达到显著水平，增幅分别为19.5%和28.2%(图5，A)。AM组的最大光化学效率仅在盐碱浓度为7.5 g·kg-1时产生显著影响，比NAM组显著提高了11.3%(图5，B)。AM组的光化学猝灭系数也均不同程度地高于相应NAM组，但仅在盐碱浓度为6.0和7.5 g·kg-1时与NAM组差异显著(图5，C)。AM组的杜梨的非光化学猝灭系数仅4.5 g·kg-1时稍高于NAM组，在其余浓度下均不同程度地低于相应NAM组，并且在盐碱浓度为1.5、3.0和7.5 g·kg-1时差异达到显著或者极显著水平(图5，D)。可见，在盐碱胁迫条件下，接种Ri可通过抑制杜梨幼苗热耗散来增加其光化学效率。

2.6 盐碱胁迫下接种根内根孢囊霉对杜梨叶片抗氧化酶活性及膜系统的影响

图6，A、B显示，杜梨叶片细胞膜透性(相对电导率)和丙二醛的含量随着盐胁迫浓度的增加呈现逐渐上升的趋势，但AM组在各浓度盐碱胁迫下均比NAM组极显著降低，其细胞膜透性降幅在40%～59%之间并始终保持在较低水平，其MDA含量降幅在17%～55%之间。同时，图6，C、D显示，杜梨叶片超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的活性随着盐胁迫浓度的增加基本呈现先上升后下降的趋势，但AM组均不同程度地高于NAM组，且在大多数浓度下差异达到显著水平，尤其在高盐碱浓度胁迫(6 g·kg-1和7.5 g·kg-1)下增幅均超过40%。由此可以看出，接种Ri能够显著增强盐碱胁迫下杜梨叶片抗氧化酶活性，有效降低细胞膜的过氧化损伤程度，提高植植株对盐碱胁迫的耐受能力。

2.7 盐碱胁迫下接种根内根孢囊霉对杜梨叶片可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响

图7显示，随着盐碱胁迫浓度的增加，AM组杜梨叶片的可溶性糖和可溶性蛋白含量呈现先升后降的变化趋势，并分别在4.5和3.0 g·kg-1浓度下达到最大值，且与相应NAM组相比均显著提高，其可溶性糖含量增幅在16%～77%之间(图7，A)，其可溶性蛋白含量增幅在24%～87%之间(图7，B)。可见，接种Ri显著提高了盐碱胁迫下杜梨叶片的渗透调解能力。

3 讨 论

3.1 盐碱胁迫下根内根孢囊霉对杜梨根系侵染率及生长的影响

菌根侵染率能够直观反映出菌根的形成和真菌与植物之间亲和力的高低[20]。本试验结果表明，根内根孢囊霉能够很好地侵染进杜梨根系，与杜梨根系形成共生体；在盐碱胁迫浓度小于4.5 g·kg-1时，盐碱胁迫对根内根孢囊霉的侵染影响较小，侵染率为79%以上，但浓度高于4.5 g·kg-1后，侵染率显著下降。然而前人有关AMF对杜梨的侵染率范围仅在17.9%～30.7%[15]，这可能是由于摩西管柄囊霉虽然能够与杜梨形成共生体，但是亲和力相对较差，并且其试验仅使用了单一碱性盐(Na2CO3)，并不能较好反映自然情况。而本试验选取的根内根孢囊霉是在自然环境杜梨人工林根际土壤中获得的，这可能使得根内根孢囊霉与杜梨根系具有较好的亲和能力。前人有关不同AMF侵染杜梨的试验表明[14]，摩西球囊霉、根内球囊霉、地表球囊霉均能较好地与杜梨根系亲和，然而该试验针对杜梨的盐处理仅为单一中性盐(NaCl)，且该杜梨在盐浓度为0.5%时便开始死亡，这与本试验结果相差较大，这可能是由于其试验中的杜梨对于盐分含量较敏感，本身耐盐能力相对较差，并且有学者发现杜梨存在能够在0.8% NaCl下仍然有60%以上存活率的家系[13]。本试验发现根内根孢囊霉能够较好地适应中低盐碱环境，但如果土壤盐碱含量过高，则可能会抑制AMF的活性，抑制AMF孢子的萌发与减少孢子数量，减少丛枝与泡囊的数量，抑制芽管的伸长和菌丝分枝，降低菌根的侵染范围，抑制形成菌根[21-22]。本研究中当杜梨根系与AMF形成良好的共生体后，菌根促进了杜梨的生长，显著增加了杜梨苗高生长量和生物量的积累，这在榉树[23]、美洲黑杨[24]等植物中均有体现。这可能是由于AMF与植株形成共生系统后，数量庞大的菌丝系统极大地扩展了根系的吸收范围，有利于植物根系从土壤中吸收水分和营养物质[25]，从而能够促进植物的生长和生物量的积累，增强植物对盐胁迫的抵抗能力。

3.2 根内根孢囊霉对盐碱胁迫下杜梨光合生理特性的影响

叶绿素是植物进行光合作用的光敏催化剂，是高等植物进行光合作用时最重要的色素，其含量是反映植物光合强度的重要指标[26]。本研究发现，接种根内根孢囊霉显著增加了杜梨叶片叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量，但对类胡萝卜素含量的影响较小。光合作用的限制因素主要分为气孔和非气孔两个限制因素。当Pn下降的时候，Ci与Gs同时下降，这就说明限制植物光合作用的因素主要为气孔因素；相反，当Pn下降，但Ci上升，这说明影响植物光合能力的因素主要是叶肉细胞的光合活性下降等非气孔因素[27]。本试验在中低盐碱胁迫程度(1.5 g·kg-1和3.0 g·kg-1)下，杜梨叶片Pn下降，但Ci增加，这说明此时限制光合能力的主要是非气孔因素；然而在中高盐碱胁迫程度下(4.5、6.0、7.5 g·kg-1)，杜梨叶片Pn下降的同时，Gs与Ci均下降，这说明此时限制杜梨光合能力的主要是由于气孔因素。因此，杜梨遭受盐碱胁迫后光合速率的下降既有气孔因素也有非气孔因素，可能是气孔限制和非气孔限制共同作用的结果[28]。并且，接种根内根孢囊霉能够显著增加叶绿素含量，缓解盐碱胁迫对于叶绿体的损伤，从而缓解杜梨光合作用下降中的非气孔因素，同时能够促进叶片中气孔的开度，来缓解光合作用下降中的气孔因素。此外，本试验还发现，接种AMF能够显著提高在不同程度的盐碱胁迫下杜梨叶片的实际光化学效率，在高盐碱环境中显著提高其最大光化学效率和光化学猝灭系数，并在除4.5 g·kg-1浓度之外的盐碱胁迫下不同程度降低了非光化学猝灭系数。这可能是接种AMF能够有效提高光化学量子效率和增强电子传递的能力，能够将叶片吸收的光能更多的利用在光合作用中，从而提高杜梨叶片对光能的利用效率，缓解盐碱胁迫对于杜梨叶片光合作用的抑制作用，该作用在其他植物中也有报道[29]，这均说明菌根能够增加宿主植物对光能的捕获和光化学效率[30]。

3.3 根内根孢囊霉对盐胁迫下杜梨叶片抗逆生理指标的影响

盐碱胁迫能够导致细胞膜受损，使细胞胞液外渗，从而使相对电导率增加，因此电导率能够反映出细胞膜的受损程度[29]。盐胁迫会导致植物体内活性氧积累，使细胞内膜脂过氧化程度提高，生成的MDA含量增加，因此MDA含量能够反映出细胞膜脂的过氧化程度[31]。本研究发现，在盐碱胁迫条件下，接种AMF能够显著降低杜梨叶片MDA含量和相对电导率，这说明接种AMF能够减轻盐胁迫下细胞膜受损程度，缓解盐碱胁迫对细胞膜系统的毒害作用，增强植物抗逆性。同时，POD和SOD是植物细胞内主要的抗氧化酶，能够清除细胞内多余的活性氧，维持细胞的稳态。本研究发现，盐碱胁迫下接种AMF能够显著增强杜梨叶片POD和SOD活性，并在前人的相关研究中也有类似结果[14]，这说明接种AMF能够有效增强杜梨叶片的抗氧化酶系统活性，从而缓解盐碱胁迫的伤害作用，提高植物抗逆性。另外，植物体内的可溶性蛋白多数是代谢有关的酶类，能够反映出植物总代谢水平，能够维持细胞内的渗透势，促进细胞的持水能力。可溶性糖是植物耐盐碱过程中重要的调节物质，能够为有机物的合成提供能量，保持细胞膜的稳定，保护酶类[15]。本试验表明，接种AMF能够显著提高杜梨叶片的可溶性蛋白和可溶性糖含量，促进杜梨的代谢，维持细胞的渗透平衡，增强杜梨抵御盐碱胁迫的能力。

4 结 论

盐碱胁迫对于杜梨的生长具有不利影响，接种根内根孢囊霉能够通过增加杜梨叶片中的光合色素含量来缓解盐碱胁迫下非气孔因素对于光合的抑制作用，同时能够通过促进叶片气孔的开度来缓解盐碱胁迫下气孔因素对光合的抑制作用；并能够通过促进光能的吸收利用效率来促进杜梨的光合作用，从而促进杜梨的生长与生物量的累积；接种根内根孢囊霉能够通过提高杜梨叶片中的渗透物质含量来缓解细胞膜的损伤，减轻盐碱的渗透胁迫，同时还能通过提高抗氧化酶的活性缓解盐碱胁迫诱导的细胞过氧化的损害，从而提高杜梨对盐碱胁迫的耐受能力。因此，菌根化杜梨在盐碱地综合治理中具有较好的应用前景。