王 洋，崔 帅，鑫 婷，王西西，于海男，陈世钰，蒋亚君， 高新桃，庞忠宝，姜一曈，郭晓宇，贾 红，朱鸿飞*

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193；2.中国科学院微生物研究所,北京 100080； 3.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一种猪的急性、烈性、高度接触性传染病。ASFV是一种核质巨DNA病毒，基因组全长170～193 kb，编码150～167个开放阅读框。自2018年传入我国以来，非洲猪瘟疫情在全国范围内迅速扩散，给中国以及全球造成巨大的经济损失。目前，我国出现了基因I型ASFV，临床表现为亚急性型或慢性型，严重增加了ASF防控难度。ASFV编码多种蛋白质，通过干扰宿主的天然免疫系统，抑制和逃避宿主的免疫应答反应，为自身的增殖、扩散创造有利条件。例如，MGF505-7R抑制p65的磷酸化和核转移，与STING、TBK1和IKKα互作，抑制cGAS-STING通路介导的Ⅰ型干扰素的产生；MGF505-11R能够与STING互作，通过泛素化途径降解STING，从而抑制Ⅰ型干扰素的产生；E120R能够与IRF3互作，抑制TBK1对IRF3的招募和IRF3的磷酸化，从而抑制Ⅰ型干扰素的产生。

线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling, MAVS)是抗RNA病毒信号通路中的关键接头蛋白。在病毒入侵机体时，RIG-I样受体(RIG-I-like receptor, RLR)识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，RIG-I与MAVS相互作用激活MAVS，进而活化下游NF-κB和IRF3的信号通路，诱导干扰素的表达。然而，在病毒进化过程中也具备了拮抗MAVS的策略，以此逃避先天性免疫系统。例如，日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)NS1蛋白通过抑制MAVS的表达，抑制Ⅰ型干扰素的产生；口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)VP1蛋白与MAVS结合，竞争性抑制MAVS与TRAF3的结合，从而抑制Ⅰ型干扰素的产生；登革热病毒(dengue virus, DENV)NS4A蛋白与MAVS互作，抑制MAVS与RIG-I的结合，从而抑制IRF3的活化。

在研究ASFV多基因家族(multigene families，MGF)成员MGF360-14L对Ⅰ型干扰素通路影响的过程中，作者发现MGF360-14L能够与MAVS相互作用，并且能够抑制MAVS介导的Ⅰ型干扰素的产生，从而逃避宿主先天性免疫反应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人胚肾细胞HEK293T和猪肾细胞PK-15采用含有10%胎牛血清、1%双抗DMEM培养基在5% CO和37 ℃的培养箱中培养。

1.1.2 质粒 合成ASFV-18毒株360-14L全长基因(GenBank No.MH 766894)，然后亚克隆入p3×Flag-CMV-7.1质粒和pCMV-N-eGFP质粒；21和全长基因从PK-15细胞的cDNA中扩增，然后分别亚克隆入pcDNA3.1-Myc和pcDNA3.1-HA载体；cGAS、STING、TBK1、IRF3、IFN-β-luc和pRL-TK等表达质粒由本实验室保存。

1.1.3 主要试剂 兔抗TBK1/NAK、P-TBK1、IRF3、P-IRF3、GAPDH、eGFP-Tag、HA-Tag抗体和HRP标记的羊抗兔IgG抗体以及鼠抗Myc和Flag标签抗体购自Cell Signaling Technology公司；转染试剂(JetPRIME Kit)购自Polyplus Transfection公司。双荧光素酶检测试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司；HRP标记羊抗鼠IgG抗体、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂购自康为世纪生物科技股份有限公司；免疫共沉淀试剂盒(Pierce Crosslink Magnetic IP/Co-IP Kit)购自Thermo公司；羊抗鼠IgG H&L(Alexa Fluor488)和羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor594)荧光二抗购自Abcam公司；RNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)和反转录试剂盒(PrimeScriptRT Master Mix)购自宝生物(TaKaRa)公司。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 收集细胞提取总RNA，然后将RNA反转录为cDNA，具体操作步骤参见RNA提取试剂盒(TaKaRa)和反转录试剂盒(TaKaRa)。使用SYBR荧光染料和ABI7900HT荧光定量PCR仪进行样品的检测。PCR体系：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s和72 ℃ 45 s，40个循环，每个样本进行3次重复检测。RT-qPCR的引物序列:pig-GAPDH-F：5′-CGTCCCTGAGACACGATGGT-3′，pig-GAPDH-R：5′-GGAACATGTAGACCATGTAG-3′；pig-IFN-β-F：5′-GTGGAACTTGATGGGCAGAT-3′，pig-IFN-β-R：5′-TTCCTCCTCCATGATTTCCTC-3′。

1.2.2 双荧光素酶检测 首先将HEK293T细胞传代培养，然后铺48孔细胞培养板，待细胞密度达到70%左右时转染质粒。将IFN-β-luc和pRL-TK与cGAS、STNG、TBK1、MGF360-14L、TRIM21、MAVS或空载共转染。转染24 h后收集细胞，进行双荧光素酶检测，具体操作步骤参见双荧光素酶说明书(北京全式金生物技术股份有限公司)。

1.2.3 免疫共沉淀试验(Co-IP) HEK293T细胞传代培养于6孔细胞培养板中，待细胞密度达到70%左右，依据具体试验转染p3×Flag-MGF360-14L、p-CMV-eGFP-MGF360-14L、pcDNA3.1-Myc-TRIM21、pcDNA3.1-HA-MAVS、p3×Flag-MAVS、pCDEF-HA-Ub或空载质粒转。转染后24 h，细胞用预冷的PBS洗3次，然后用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的IP裂解液裂解细胞，在4 ℃条件下，12 000×离心10 min，取上清，4 ℃保存备用。将磁珠与标签抗体Flag或HA在旋转器上室温孵育1 h，然后清洗结合了抗体的磁珠，再将制备好的细胞上清与磁珠4 ℃过夜孵育，清洗磁珠后用洗脱液洗脱，洗脱下来的样品加入loading buffer 100 ℃煮10 min，进行SDS-PAGE分析。

1.2.4 间接免疫荧光试验(IFA) HEK293T细胞铺于激光共聚焦培养皿上，待细胞密度达到70%左右，转染p3×Flag-MGF360-14L和pcDNA3.1-HA-MAVS质粒。转染24 h后，用4%的多聚甲醛固定细胞20 min，然后0.1% Triton X-100透膜15 min，5%的BSA封闭1 h，一抗分别采用鼠抗Flag和兔抗HA标签抗体4 ℃过夜孵育，二抗分别采用羊抗鼠IgG H&L(Alexa Fluor488)和羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor594)抗体37 ℃孵育1 h，最后用DAPI着染细胞核，置荧光显微镜下观察。

1.2.5 Western blot分析 转染了相应质粒的HEK293T细胞被含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液裂解后，在4 ℃ 12 000×离心10 min，收集裂解液上清。采用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo)对收集的裂解液进行蛋白定量。裂解液加入SDS-PAGE loading buffer后100 ℃煮沸10 min，上样进行SDS-PAGE，并进行转膜。用5%脱脂乳封闭后，分别用对应蛋白或标签的抗体孵育，然后进行二抗孵育，最后进行ECL显色。

1.2.6 数据分析 本研究中的试验均进行3次独立的重复，使用GraphPad Prism 8软件对试验数据进行统计分析分析方法采用Student’s-test(.<0.05；.<0.01；.<0.001)。

2 结 果

2.1 ASFV MGF360-14L抑制MAVS介导的Ⅰ型干扰素通路

已有研究表明，ASFV MGF的一些成员能够抑制Ⅰ型干扰素的产生。为了确定MGF360-14L对Ⅰ型干扰素的影响，将MGF360-14L-Flag质粒转染HEK293T细胞，并用5 μg·mL的poly(I:C)诱导干扰素的产生。RT-qPCR检测结果显示，MGF360-14L能够明显抑制poly(I:C)诱导的-β mRNA的产生(图1A)，荧光素酶试验结果显示MGF360-14L能够抑制MAVS诱导的IFN-β启动子活性(图1B)。

A.HEK293T细胞转染MGF360-14L-Flag蛋白表达质粒和poly(I:C)后24 h收集细胞，用RT-qPCR检测IFN-β mRNA；B. 双荧光素酶检测MAVS诱导的IFN-β启动子活性，并进行相对应的Western blot检测A. HEK293T cells were co-transfected with the MGF360-14L-expressing plasmid and poly(I:C) for 24 h and then harvested for RT-qPCR assay to determine IFN-β mRNA levels; B. Double luciferase was used to detect IFN-β promoter activity induced by MAVS, expression of MAVS-HA and MGF360-14L-Flag was analyzed by Western blot图1 ASFV MGF360-14L蛋白基因对MAVS信号通路的抑制Fig.1 MGF360-14L inhibited IFN-β mRNA production and IFN-β promoter activity

2.2 MGF360-14L与MAVS互作

由于MGF360-14L能够抑制MAVS介导的IFN-β的产生，为确定其具体作机制，作者将MGF360-14L-Flag和MAVS-HA质粒共转染HEK293T细胞，进行Co-IP试验，结果表明，MGF360-14L能够与MAVS结合(图2A)，反过来MAVS同样能够与MGF360-14L结合(图2B)。并且共定位试验表明，MGF360-14和MAVS存在胞质内共定位(图2C)。

A、B. MGF360-14L-Flag和MAVS-HA共转染HEK293T细胞中，转染后24 h收集细胞进行Co-IP试验；C.将MGF360-14L-Flag和MAVS-HA共转染铺有HEK293T细胞进行IFA试验，标尺为25 μmA, B. HEK293T cells were co-transfected with MGF360-14L-Flag and MAVS-HA plasmids, the cells were collected 24 h after transfection for Co-IP assay; C. HEK293T cells were transfected with MGF360-14L-Flag and MAVS-HA plasmids for laser confocal test. The scale is 25 μm图2 ASFV MGF360-14L蛋白与MAVS互作Fig.2 MGF360-14L interacts with MAVS

2.3 MGF360-14L抑制TRIM21和MAVS诱导的IRF3磷酸化及IFN的产生

三重基序蛋白21(tripartite motif protein 21, TRIM21)能够促进线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)的K27多聚泛素化从而增强TBK1的招募和活化IRF3，从而启动Ⅰ型干扰素的表达。为了确定MGF360-14L是否能够抑制TRIM21和MAVS引起的Ⅰ型干扰素的产生，作者将不同浓度的MGF360-14L、TRIM21、MAVS以及启动子报告基因IFN-β-luc和内参报告基因pRL-TK共转染HEK293T细胞，进行双荧光素酶检测。结果显示，MGF360-14L能够抑制TRIM21和MAVS共同诱导的IFN-β启动子活性，且呈剂量依赖性(图3A)。已有研究表明，TRIM21通过与MAVS作用，促进IRF3的磷酸化，促进Ⅰ型干扰素的产生。作者将MGF360-14L-Flag、TRIM21-Myc和MAVS-HA共转染HEK293T细胞后，进行Western blot分析，结果显示，MGF360-14L对MAVS和TRIM21诱导的TBK1和IRF3磷酸化具有抑制作用(图3B)。

A. 双荧光素酶检测不同浓度的ASFV MGF360-14L蛋白对MAVS/TRIM21诱导的IFN-β启动子活性的抑制作用；B. Western blot 检测MGF360-14L蛋白对MAVS诱导的TBK和IRF3的抑制作用A. Dual luciferase assay was used to detect the inhibitory effect of different concentrations of ASFV MGF360-14L on MAVS/ TRIM21-induced IFN-β promoter activity; B. TRIM21-Myc,TBK1, P-TBK1, IRF3, P-IRF3, MAVS-HA and MGF360-14L-Flag were analyzed by Western blot图3 ASFV MGF360-14L抑制MAVS诱导的TBK1和IRF3的磷酸化Fig.3 MGF360-14L inhibits the phosphorylation of TBK1 and IRF3

2.4 MGF360-14L竞争性结合MAVS

前期研究结果表明，MGF360-14L和TRIM21互作，并且TRIM21与MAVS也具有相互作用。为了探究MGF360-14L蛋白、TRIM21和MAVS三者之间的相互作用，将TRIM21-Myc和MAVS-Flag质粒共转染HEK293T细胞，或者不同浓度的MGF360-14L-eGFP与TRIM21-Myc和MAVS-Flag表达质粒共转染HEK293T细胞，Co-IP竞争试验结果显示，MAVS与TRIM21结合，在转染MGF360-14L质粒后，MAVS能与MGF360-14L互作，且MGF360-14L存在时MAVS与TRIM21的互作被减弱(图4A)。将TRIM21-Myc、MAVS-Flag和Ub-HA共转染HEK293T细胞或者MGF360-14L-eGFP、TRIM21-Myc、MAVS-Flag和Ub-HA共转染HEK293T细胞，Western blot检测结果表明，TRIM21能够促进MAVS的泛素化，MGF360-14L对TRIM21促进MAVS的泛素化有抑制作用(图4B)。综上所述，作者推测MGF360-14L通过与TRIM21竞争结合MAVS，抑制了TRIM21诱导的MAVS的泛素化，从而抑制Ⅰ型干扰素的产生。

A. 将ASFV MGF360-14L-eGFP、MAVS-Flag和TRIM21-Myc蛋白表达质粒共转染HEK293T细胞，进行Co-IP和Western blot检测；B. 将MGF360-14L-eGFP、MAVS-Flag、RIM21-Myc和Ub-HA蛋白表达质粒共转染HEK293T细胞，进行Co-IP试验以及Western blot检测A. HEK293T cells were transfected with MGF360-14L-eGFP, TRIM21-Myc, MAVS-Flag. Co-IP and Western blot were performed 24 h after transfection; B. HEK293T cells transfected with MGF360-14L-eGFP, TRIM21-Myc, MAVS-Flag and Ub-HA, Co-IP and Western blot were performed 24 h after transfection图4 ASFV MGF360-14L抑制MAVS的泛素化Fig.4 MGF360-14L inhibits the ubiquitination of MAVS

3 讨 论

MGF360-14L为ASFV的一种非结构蛋白，位于ASFV基因组左侧可变区。已有文献报道，当缺失强毒株Georgia/2007的6个MGF基因(包括MGF360-14L)，以及缺失强毒株ASFV HLJ/18的7个基因(包括MGF360-14L)后，缺失株ASFV-G-MGF和HLJ/18-7GD免疫猪均能完全抵抗强毒株的攻击。但仅缺失强毒株Georgia/2007的MGF360-13L和MGF360-14L并未影响ASFV在细胞上的复制水平和对猪的致病性，提示MGF360-14L可能不是ASFV的毒力基因。但我们的前期研究结果表明，MGF360-14L能够与IRF3互作，并通过招募TRIM21介导IRF3的K63位多聚泛素化，从而抑制IFN-β的产生，由此推测MGF360-14L可能参与ASFV逃避宿主先天性免疫系统，促进ASFV的感染。

虽然MAVS作为RNA病毒抑制Ⅰ型干扰素的靶基因，也有相关文献报道某些DNA病毒能与MAVS互作，从而抑制Ⅰ型干扰素的产生。例如，卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)的外膜蛋白ORF33与STING和MAVS互作，招募PPM1G促进STING和MAVS的去磷酸化，从而促进KSHV逃避先天性免疫反应；I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1, HSV-1)的US11蛋白能够与RIG-I相互作用，抑制RIG-I和MAVS的互作，从而下调Ⅰ型干扰素的表达；人疱疹病毒6B(human herpesvirus 6B, HHV-6B)的U26蛋白能够降解MAVS，抑制RIG-I/MAVS信号通路介导的先天性免疫反应。也有研究表明，在病毒感染过程中，E3泛素连接酶TRIM21能够靶向MAVS的K27多聚泛素化，促进TBK1的招募，从而上调Ⅰ型干扰素的表达，提高机体先天性免疫反应抵抗病毒入侵。

为了探讨MGF360-14L是否通过MAVS途径抑制Ⅰ型干扰素，从而逃避宿主先天性免疫系统，本研究采用双荧光素酶试验检测MGF360-14L对MAVS诱导的IFN-β启动子活性的影响，Co-IP和共定位检测MGF360-14L与MAVS的互作关系，及Western blot分析MGF360-14L对MAVS和TRIM21诱导的TBK1和IRF3磷酸化的影响。研究结果显示，MGF360-14L能抑制MAVS所诱导的IFN-β mRNA水平和启动子活性(图1A、B)。Co-IP试验表明，MGF360-14L与MAVS具有相互作用，但并未进行内源性的互作研究，而共定位试验显示，二者存在胞质内的共定位(图2A～C)。进一步的研究表明，MGF360-14L能够抑制TRIM21和MAVS共同诱导的IFN-β启动子活性，并且对MAVS和TRIM21诱导的TBK1和IRF3磷酸化也具有抑制作用(图3A和B)，作者初步推断MGF360-14L与MAVS互作从而抑制IFN-β的产生。此外，MGF360-14L可能通过与TRIM21竞争结合MAVS，抑制TRIM21对MAVS的泛素化作用(图4A和B)。本研究进一步探讨了MGF360-14L的逃避宿主先天性免疫的作用机制，为ASF疫苗的研制提供线索。

4 结 论

非洲猪瘟病毒MGF360-14L通过与MAVS互作，抑制了TRIM21诱导的MAVS的泛素化，从而抑制Ⅰ型干扰素的产生。