姚馨悦，吉佳乐，叶双慧，赵庆宁，何志承

在病理制片过程中常会遇到骨组织或钙化组织，由于其含有丰富的骨盐，导致制片效果不佳，需使用脱钙液进行脱钙预处理。在日常工作中，对脱钙液的要求包括：脱钙时间短，能较好地保存骨组织形态以及各类抗原等。目前，各实验室常用的脱钙液效果参差不齐，影响病理诊断的准确性。因此，迫切需要一种较为理想的脱钙条件应用于日常骨组织的处理。根据以往研究结果[1-3]，本实验将10%EDTA、5%盐酸氯化钠、5%硝酸甲醛、5%盐酸甲醛4种脱钙液进行对比，分别在室温静置、超声、微波条件下对脱钙时间及效果进行分析，以期摸索出更为适合日常骨组织处理的脱钙液及使用条件。

1 材料与方法

1.1 组织标本选取陆军军医大学第一附属医院送检的骨组织8例，每例分别用骨锯切成大小1 cm×1 cm×0.3 cm的骨块12个，经10%中性福尔马林固定24 h，用于后续脱钙实验。

1.2 脱钙液10%EDTA脱钙液：购于赫特生物公司。5%盐酸氯化钠脱钙液：5 mL HCl，15 g NaCl，蒸馏水加至100 mL。5%硝酸甲醛脱钙液：10%中性福尔马林10 mL，硝酸5 mL，蒸馏水加至100 mL。5%盐酸甲醛脱钙液：10%中性福尔马林10 mL，浓盐酸5 mL、蒸馏水加至100 mL。

1.3 主要仪器Leica 2245石蜡切片机，Leica AacadiaH全自动包埋机，Leica ASP300S脱水机，Leica Autostainer XLST5010自动染色机，昆山KQ-500DV型数控超声波清洗器，格兰仕P70D20TL-D4型微波炉。

1.4 方法

1.4.1实验分组 将所有组织标本分为三组，并按照不同条件进行脱钙：第一组为室温静置脱钙；第二组为微波脱钙；第三组为超声脱钙。

1.4.2脱钙方法 (1)第一组：室温下将标本分别放入装有4种脱钙液的烧杯中静置，每隔12 h换1次脱钙液，直至脱钙终点。(2)第二组：将标本分别置于4个试管内，再分别加入4种脱钙液。将试管放入装有250 mL蒸馏水的500 mL烧杯中，并将微波炉调至最低档(输出功率120 W)，脱钙5 min后取出，更换烧杯中的水，室温条件下降温2 min，再重复上述步骤脱钙5 min，震荡混匀脱钙液，每隔30 min换1次脱钙液，直至微波处理累积90 min，最后静置至脱钙终点。(3)第三组：将标本分别放置于装有4种脱钙液的烧瓶中，并放入超声波清洗器中进行超声脱钙(超声频率40 KHZ)，脱钙5 min，静置2 min(脱钙时间与微波组相同)，继续置入超声仪中处理5 min，每隔30 min换1次脱钙液，直至超声累积处理90 min，再静置至脱钙终点。

1.4.3脱钙终点判断 脱钙处理后，每隔12 h更换1次脱钙液，每隔1 h观察脱钙情况，以大头针能轻松刺进骨皮质作为脱钙终点标志。

1.4.4脱钙后处理 脱钙后标本流水冲洗30 min，常规脱水，切片，行HE染色和免疫组化EnVision法染色检测SATB2的表达，镜下观察组织的结构及染色情况。

2 结果

2.1 脱钙时间比较4种脱钙液脱钙时间：5%硝酸甲醛脱钙液<5%盐酸甲醛液脱钙液<5%盐酸氯化钠脱钙液<10%EDTA脱钙液。比较同一脱钙液中的三种脱钙处理条件：微波条件下耗时最短，超声条件次之，室温静置最慢。结合以上两种结果初步得出以下结论：工作中可选用5%硝酸甲醛脱钙液，利用微波条件进行脱钙，耗时最短(表1)。

表1 不同脱钙液与脱钙条件对脱钙时间的影响

2.2 HE染色效果比较10%EDTA脱钙液与5%硝酸甲醛脱钙液处理后的骨组织脱钙充分均匀，切片完整不易掉片，且切片无皱痕、无刀痕，镜下见组织结构完整，骨板形态清晰，细胞核呈蓝色，核仁清晰，核质对比鲜明(图1A、B)。5%盐酸甲醛脱钙液效果稍次之，镜下见组织结构完整，但部分核红染、核质对比不佳(图1C)。5%盐酸氯化钠脱钙液效果最差，切片过程中部分组织有沙粒感，脱钙不均匀，镜下可明显观察到核染色发红且结构不清(图1D)。室温静置条件下脱钙效果最好，微波、超声条件均较好。比较分析4种HE染色结果显示：10%EDTA脱钙液与5%硝酸甲醛脱钙液处理后的骨组织，HE染色效果最佳。

图1 微波条件下经4种脱钙液脱钙的骨组织：A.10%EDTA脱钙液脱钙的骨组织；B.5%硝酸甲醛脱钙液脱钙的骨组织；C.5%盐酸甲醛脱钙液脱钙的骨组织；D.5%盐酸氯化钠脱钙液脱钙的骨组织 图2 微波条件下经4种脱钙液脱钙的骨组织免疫组化染色：A.10%EDTA脱钙液脱钙的骨组织中SATB2的表达，EnVision法；B.5%硝酸甲醛脱钙液脱钙的骨组织中SATB2的表达，EnVision法；C.5%盐酸甲醛脱钙液脱钙的骨组织中SATB2的表达，EnVision法；D.5%盐酸氯化钠脱钙液脱钙的骨组织中SATB2的表达，EnVision法

2.3 免疫组化SATB2染色效果比较标本经4种脱钙液脱钙后行免疫组化染色，SATB2均阳性，其中10%EDTA脱钙液(图2A)与5%硝酸甲醛脱钙液(图2B)处理后的骨组织免疫组化染色效果最佳，阳性细胞表达明显且定位准确，但也存在部分非特异性着色情况。5%盐酸甲醛脱钙液脱钙处理后免疫组化染色掉片较为严重(图2C)，且存在部分非特异性着色；5%盐酸氯化钠脱钙液脱钙处理后免疫组化阳性信号较弱且轻微卷片(图2D)。微波条件下效果最好，超声次之，室温静置条件下相对最差。比较4种脱钙液脱钙后的免疫组化染色结果显示：10%EDTA脱钙液和5%硝酸甲醛脱钙液处理后的骨组织SATB2染色效果最佳。

3 讨论

组织内含有骨质或钙化灶时，直接脱水包埋后切片质量差，故需先进行脱钙处理，软化组织后再进行脱水包埋切片。骨质由有机成分和无机成分组成，有机成分由90%胶原纤维和基质组成，无机成分由骨盐组成，骨盐是羟基磷灰石结晶，沉淀于纤维间，主要有钙、镁、磷等。脱钙是指运用物理或者化学方法将骨组织标本中有机成分和骨盐分离，通过去除钙盐从而获得完整的胶原纤维组织和基质[4]，进而使组织变软易于制片染色。在常规病理切片过程中，如果脱钙液使用不正确会严重破坏组织结构和细胞形态，影响最终病理诊断的准确性。因此，寻找一种对组织破坏程度较小且脱钙效率高的脱钙液，对临床病理诊断工作意义重大。

本实验发现经5%盐酸氯化钠脱钙液脱钙后的组织，HE染色示细胞核发红现象明显，核结构不清，染色对比度差，且免疫组化染色SATB2表达效果不佳；而5%盐酸甲醛脱钙液脱钙后组织HE染色效果比5%盐酸氯化钠脱钙液效果佳，结构更为完整。盐酸是一元无机强酸，与骨组织中骨盐结合可加速脱钙。曹颖[1]实验发现氯化钠可降低溶液中离子的活度，导致骨组织中骨盐(羟基磷灰石结晶)的溶解度增加、胶原纤维的酸解程度降低，而10%中性福尔马林是组织固定最常用的试剂，组织渗透力强、收缩小，能够较好保存多数的抗原物质，由于10%中性福尔马林中加入磷酸缓冲液，不易被氧化，故对组织标本的固定(特别是长期固定)、染色效果较为有利，在脱钙液中加入10%中性福尔马林后加快脱钙速度的同时又能保护细胞形态及抗原，且穿透力强，固定均匀[5]。此外，本实验发现延长脱钙时间后，10%EDTA脱钙液脱钙效果最佳，且免疫组化染色结果更为稳定。由于EDTA是一种相对较好的螯合脱钙剂，对组织结构、细胞形态影响较小，且能较好地保存组织中的抗原物质和某些酶类的活性[6]，经10%EDTA脱钙液脱钙后的组织行HE和免疫组化染色效果佳，且不易掉片，但因其脱钙时间过长，不推荐用于临床诊断的骨组织脱钙；5%硝酸甲醛脱钙液中，硝酸是一种强氧化性和腐蚀性的强酸，是六大无机强酸之一，且低浓度的硝酸能较好的保持组织的完整性和细胞形态。本实验中5%硝酸甲醛脱钙液脱钙时间明显低于10%EDTA脱钙液，且两种脱钙液HE染色与免疫组化染色效果相差较小，镜下无皱缩、龟裂、膨胀现象，切片平整，厚薄均匀。综合以上各种脱钙液的优缺点，联合临床实际，推荐使用5%硝酸甲醛脱钙液作为临床工作中的常用脱钙液。

室温静置条件下，组织脱钙时间较长(24～48 h)，严重影响病理报告的时效性；而微波、超声均可加强试剂对组织的穿透作用，从而加快脱钙速度，且抗原保存得更好，同时微波、超声过程中需不断更换脱钙液，在防止温度过高的同时，也可将脱掉的钙盐弃掉，增加脱钙强度[7]。微波电磁场将能量直接作用于脱钙组织，增大脱钙液穿透力，使脱钙液与组织充分接触，但是由于高温会破坏组织细胞形态，本实验使用间歇性微波辐射控制脱钙液，避免高温对组织的影响，以达到最佳脱钙效果；超声波发射的波长短、频率高，故传播方向性好且穿透能力强。经研究发现[8]，超声波可加速脱钙液中分子运动，加强对骨组织的渗透作用，超声波不能加热试剂，所以结合恒温水浴，控制骨组织在合适的温度下进行处理，既可以避免高温引起的组织收缩破坏及蛋白抗原变性，又可以加快脱钙液对组织的渗透速度，从而缩短脱钙时间。

另外，在日常工作中对骨组织进行脱钙操作时还应注意以下几点：(1)对组织进行及时、充分固定，才能保存好形态结构和组织细胞的抗原性，由于固定不充分对组织的损伤是不可逆性的，所以脱钙前组织固定尤为重要；(2)脱钙终点选择需谨慎，脱钙不彻底则无法切片，脱钙过度则会导致细胞形态破坏，影响诊断；脱钙终点的物理法测定包括手掐、针刺、钳夹等方法，手轻轻按压组织柔软有弹性、不刺手、无粗糙砂粒感，大头针可以轻松刺入骨皮质判断为达到脱钙终点；(3)脱钙后需用流水彻底冲洗30 min，以避免酸性液体残存，导致HE染色时核质对比不清晰，细胞核着色暗淡[9]。

本组中10%EDTA脱钙液、5%硝酸甲醛脱钙液，在不同的处理条件下均能取得较好的脱钙效果，5%盐酸甲醛脱钙液脱钙后进行免疫组化染色易掉片或卷片，5%盐酸氯化钠脱钙液对组织损伤较大，不宜使用。同时，微波、超声条件下均能提高脱钙速度，相比之下，微波比超声效果更好，条件更稳定。联合临床病理诊断的时效性，我们推荐在微波条件下使用5%硝酸甲醛脱钙液，可在较短的时间内获得最佳的脱钙效果。