王 进，张青华，廖文斌，林本厚，杨圣双

（浙江禾本科技股份有限公司，浙江 温州 325008）

苯醚甲环唑是新型广谱三唑类杀菌剂[1]，内吸性极强，可有效抑制病菌细胞膜中麦角甾醇的合成，抑制真菌的正常发育，主要用于谷物、葡萄、马铃薯、香蕉、观赏植物和多种蔬菜作物，可防治黑星菌属、白粉菌、锈病菌科、链格孢菌、球腔菌等多种病菌导致的病害[2-5]。异菌脲属于广谱二酰亚胺类杀菌剂，可有效抑制孢子和菌丝生长，主要用于谷物、果树、蔬菜、棉花、油菜、向日葵等，防治纹枯病菌、黑星粉菌、葡萄孢菌、伏革菌等病菌引起的病害[6-7]。

45%苯醚甲环唑·异菌脲悬浮剂由苯醚甲环唑和异菌脲复配而成，能有效防治瓜果和蔬菜的多种真菌类病害[8]。目前，已有关于苯醚甲环唑和异菌脲单剂的分析方法，但二者复配制剂的分析方法尚未见报道。本文采用反相色谱法，使用C18柱和可变波长紫外检测器，对苯醚甲环唑和异菌脲进行分析和定量。此方法适用于单一成分的苯醚甲环唑、异菌脲原药以及复配制剂的分析，方法准确、简便，速度快，重复性好。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：Agilent1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪，G7115A型DAD检测器，色谱柱：Shimadzu VP-ODS柱（4.6 mm×150 mm×5μm）。CPA225D型分析天平（精度0.00001g），PMI-300TD型超声波清洗器，有机微孔滤膜（孔径0.45μm）。

试剂：甲醇（CR）、乙腈（CR）、磷酸（AR）、新制超纯水、溶样溶液（甲醇∶0.1%磷酸溶液=60∶40）、苯醚甲环唑标样（含量99.4%，白色固体）、异菌脲标样（含量98.9%，白色固体）、45%苯醚甲环唑·异菌脲悬浮剂。

1.2 色谱工作条件

流动相：等度洗脱，V（甲醇）∶V(乙腈）∶V（0.1%磷酸溶液）=50∶20∶30；流动相流速1.0mL· min-1，柱温35℃（温差不大于2℃）；测定波长230 nm，进样量5 μL；保留时间：异菌脲约6.8 min，顺式苯醚甲环唑约11.7 min，反式苯醚甲环唑约12.1 min。

上述操作条件可根据仪器进行适当调整。苯醚甲环唑、异菌脲标样的液相色谱图见图1，试样的液相色谱图见图2。

图2 45%苯醚甲环唑·异菌脲悬浮剂试样的液相色谱图Fig. 2 Liquid chromatogram of 45% difenoconazole and iprodione SC sample

1.3 测定步骤

1.3.1 标样溶液的配制

准确称取0.02g苯醚甲环唑标样（精确至0.00001g）和0.03g异菌脲标样（精确至0.00001g）于同一50 mL容量瓶中，加入30mL溶样溶液溶解，超声波振荡5min，冷却至室温，再用溶样溶液稀释至刻度，摇匀，过滤备用。

1.3.2 试样溶液的配制

称取45%苯醚甲环唑·异菌脲悬浮剂试样约0.2g（精确至0.00001g）于50mL容量瓶中，加入1mL水，超声使其分散，再加入30mL溶样溶液溶解，超声波振荡3min，冷却至室温，用溶样溶液稀释至刻度，摇匀，使用前用0.45μm有机膜过滤。

1.3.3 测定

在上述色谱工作条件下，待基线平稳后，连续进样数针标样溶液（其中苯醚甲环唑的峰面积为顺式苯醚甲环唑和反式苯醚甲环唑的面积之和），直至相邻两针的峰面积差小于1.5%。按标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序依次进行分析。

1.3.4 计算

测定完成后，将测得的同一试样溶液的前后两针苯醚甲环唑（或异菌脲）的峰面积，及前后两针标样溶液的苯醚甲环唑（或异菌脲）的峰面积分别进行平均。试样中苯醚甲环唑（或异菌脲）的质量分数W（%）按式（1）计算：

其中，A1是标样溶液中苯醚甲环唑峰面积（或异菌脲峰面积）的平均值；A2是试样溶液中苯醚甲环唑峰面积（或异菌脲峰面积）的平均值；m1是苯醚甲环唑（或异菌脲）标样的质量，g；m2是试样的质量，g；w是苯醚甲环唑（或异菌脲）标样的纯度，%。

2 结果与分析

2.1 液相色谱条件的选择

苯醚甲环唑和异菌脲的紫外光谱图见图3、图4。由图3和图4可知，苯醚甲环唑和异菌脲分别在202nm和212nm有最大吸收，但受到溶剂和试样中杂质的干扰明显，且响应值过大，易超过最大响应值。两者在230nm处均有较强的吸收，灵敏度较高，能避免溶剂和试样杂质吸收的干扰，满足实验要求，因此确定检测波长为230 nm。

图3 苯醚甲环唑的紫外吸收光谱Fig. 3 UV absorption of difenoconazole

图4 异菌脲的紫外吸收光谱Fig.4 UV absorption of iprodione

大量实验证明，异菌脲在中性和碱性条件下非常不稳定，因此本实验采用甲醇+0.1%磷酸溶液作为溶样溶液，可以确保苯醚甲环唑和异菌脲的稳定性。

色谱柱选用最常用的C18柱（4.6mm×150mm ×5μm），分离效果好，分析时间短，重现性好。为确保苯醚甲环唑和异菌脲能完全分离，经调试，以甲醇、乙腈和0.1%磷酸为流动相，最终确定比例为V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(0.1%磷酸)=50∶20∶30，流速为1.0 mL·min-1。在该条件下，苯醚甲环唑和异菌脲的分离效果好，峰形较好，峰纯度符合要求。

2.2 分析方法的线性关系测定试验

按照1.3试样溶液的制备方法，分别称取6个不同质量的苯醚甲环唑和异菌脲标样，配成质量浓度不同的苯醚甲环唑和异菌脲标样溶液，以苯醚甲环唑（或异菌脲）的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到两者的线性相关曲线，结果见图5和图6。苯醚甲环唑的线性方程为：y=12904.2530x-23.1570，相关系数r==，r＞0.99。异菌脲的线性相关方程为：y=9563.3386x+70.9366，相 关 系 数r=1.0000，r＞0.99。两者的相关系数均在线性范围内，符合定量分析要求。

图5 苯醚甲环唑的线性关系图Fig. 5 Linear relationship of difenoconazole

图6 异菌脲的线性关系图Fig. 6 Linear relationship of iprodione

2.3 方法的精密度

按照1.2的色谱条件，对同一批次的45%苯醚甲环唑·异菌悬浮剂试样进行了6次重复测定。实验结果表明，苯醚甲环唑的标准偏差为0.082%，相对标准偏差RSD为0.46%，重复性测定结果小于0.67×2(1-0.5×logC)（修订后Horwits公式值 为1.74）；异菌脲的标准偏差为0.132%，相对标准偏差RSD为0.50%，重复性测定结果小于0.67×2(1-0.5×logC)（修订后Horwits公式值为1.69）。结果表明同一批次的45%苯醚甲环唑·异菌脲悬浮剂试样的检测结果的重复性良好，符合测定要求。

表1 分析方法的精密度实验结果Table 1 Precision test results of analytical method

2.4 方法的准确度

称取0.03g苯醚甲环唑标样（精确至0.00001g）和0.02g异菌脲标样（精确至0.00001g）于同一个50mL容量瓶中，分别加入空白制剂0.06g，用溶样溶液超声溶解，定容、摇匀，于测定前过滤。在相同条件下，配制5个加标溶液，在1.2的色谱条件下进样分析，分别测定合成样品中苯醚甲环唑和异菌脲的总质量，根据实测的添加量与理论添加量的比值，计算回收率。结果显示，苯醚甲环唑和异菌脲的平均回收率分别为100.0%和99.8%，均在回收率的标准范围98%～102%内。

表2 分析方法的准确度测定结果Table 2 Accuracy test results of analytical method

3 结论

上述实验结果表明，采用高效液相色谱方法测定45%苯醚甲环唑·异菌脲悬浮剂中的有效成分含量，分离效果好，干扰少，方法简便快速，重复性好，准确度和回收率满足测定要求，是一种可行的分析方法。