胡琳琳，王雁楠，卞倩倩，尹雨萌，陈金金，杨晓平，杨育峰

（河南省农业科学院粮食作物研究所，河南 郑州 450002）

甘薯（Ipomoea batatas（L.）Lam）是我国主要的粮食作物之一，同时也是重要的工业原料及饲料作物[1-5]，以适应性广、营养价值高、产量高而著称[6-7]。病毒病是甘薯上一类比较严重的病害，对甘薯的品质与产量造成严重的危害，导致甘薯种性减退、品质产量降低、商品率降低，严重者导致绝收[8-15]。脱毒可以使甘薯恢复其原有的良种特性。目前既缺少抗病毒病的甘薯品种，又没有防治甘薯病毒病的特效药剂，因此甘薯脱毒是防范甘薯病毒病、提高甘薯产量最有效的方法之一[16-17]。郑红23号是由河南省农业科学院粮食作物研究所选育的鲜食兼淀粉型品种，该品种紫红皮白肉，抗病耐逆，综合表现优良，2013年和2019年分别通过河南省农作物品种鉴定和国家品种登记。自20世纪60年代美国学者NIELSEN首次报道利用茎尖分生组织培育技术获得甘薯脱毒植株以来，研究人员相继选取不同的甘薯品种对茎尖进行甘薯脱毒培养研究[18-24]，但植株再生效果存在较大差异且大部分已报道的再生率偏低。

河南省农业科学院粮食作物研究所甘薯研究团队前期经过多年的研究与实践，从多种生长激素中筛选出NAA、6-BA等2种生长激素进行甘薯茎尖分生组织再生研究，且发现当NAA的质量浓度为0.1 mg/L时，较适合甘薯茎尖分生组织的再生。在郑红22的脱毒研究中，先后设计了13种添加不同NAA、6-BA质量浓度的MS培养基对郑红22进行培养，所得植株最高再生率和脱毒率分别为54.58%、8.77%[9]，甘薯茎尖再生率和脱毒率偏低，还有待进一步提高。由于不同甘薯品种的基因型不同，故采用不同的培养基和培养方法获得的植株再生率和脱毒率也不同。

在前期研究基础上，本研究以郑红23号为试验材料，以期建立适合郑红23号的高效稳定的植株再生及脱毒技术体系，从而为生产更多高质量的郑红23号脱毒苗提供理论依据和技术支撑。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试甘薯品种为郑红23号。

1.2 试验方法

试验于2020—2021年在河南省农业科学院粮食作物研究所进行。

1.2.1 茎尖再生取郑红23号生长旺盛（试管苗高度约7 cm）、干净无菌的试管苗顶芽1～2 cm，在40倍解剖显微镜下剥取0.2～0.4 mm的茎尖分生组织（带1～2片叶原基），放在含有不同质量浓度6-BA（6-苄氨基嘌呤）及NAA（萘乙酸）的MS培养基（pH值为5.8）上，于27℃，3 000 lx的光照下，每日培养13 h，从而诱导芽的分化。

试验设置7个处理，即空白对照（MS培养基），MS+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA，MS+0.1 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA，MS+0.1 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA，MS+0.1 mg/L NAA+4 mg/L 6-BA，MS+0.1 mg/L NAA+5 mg/L 6-BA，MS+0.1 mg/L NAA+6 mg/L 6-BA，每个处理重复3次，每个重复30个茎尖，共计630个。观察茎尖膨大和再生出芽情况，从而对比分析茎尖在不同分化培养基上的再生效果。

1.2.2 再生植株脱毒检测将各处理再生植株转到MS培养基上，进行继代培养，取继代培养30 d内的植株叶片，液氮速冻。用CTAB法提取样品DNA，参照TRIeasy™Total Extraction Reagent（购自上海翊圣生物科技有限公司）进行植物总RNA的提取，参照TransScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒（购自北京全式金生物技术有限公司）反转录合成cDNA。采用PCR检测方法依次对甘薯卷叶病毒（Sweet potato leaf curl virus，SPLCV）、甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）、甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯潜隐病毒（Sweet potato latent virus，SPLV）和甘薯病毒G（Sweet potato virus G，SPVG）5种重要病毒进行检测（特异性引物如表1所示）。

表1 PCR扩增的特异性引物Tab.1 Specific primers for PCR amplification

使用的PCR检测反应体系如下：取样本cDNA 1μL，病毒的上、下游引物各0.5μL，Mix 12.5μL，用ddH2O补足至总体积25μL，混匀后离心。反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，54～56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35次循环；72℃终延伸10 min，4℃保存。反应进行完后，取8μL的PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，电压150 V，电泳后将胶块放置在凝胶成像仪上观察拍照。将目标条带切胶，参照胶回收试剂盒说明书进行回收纯化，然后与pMD19-Tvector连接，将连接产物转化至大肠杆菌中，之后挑取单克隆，进行菌液PCR，反应体系及条件同上述PCR检测。反应结束后，取8μL的PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，电压150 V，电泳后将胶块放置在凝胶成像仪上观察拍照，将呈阳性的菌液测 序，测序结果经NCBI BLAST比对分析。

1.3 数据处理

采用Excel对愈伤组织诱导率、再生率和脱毒率进行统计，采用SPSS 19.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同激素质量浓度配比对郑红23号茎尖苗再生的影响

2.1.1 不同激素浓度配比对愈伤组织诱导率的影响将郑红23号茎尖分生组织培养在含有不同质量浓度配比的NAA和6-BA的MS固体培养基上，7 d左右茎尖开始膨大变绿（图1-A）。在茎尖分生组织的植株再生中（表2），3次重复共培养630个茎尖，各处理均获得了较高的平均愈伤诱导率。其中，在添加0.1 mg/L NAA、6 mg/L 6-BA的分化培养基上，茎尖分生组织获得了最高的平均愈伤组织诱导率，达100%；在添加0.1 mg/L NAA、1 mg/L 6-BA的分化培养基上平均愈伤诱导率最低，为94.44%。

图1 郑红23号茎尖植株再生Fig.1 Shoot apical plant regeneration of Zhenghong 23

2.1.2 不同激素质量浓度配比对植株再生率的影响在郑红23号茎尖分生组织的植株再生中，50 d左右茎尖分生组织开始陆续再生出植株（图1-B、C），结果显示，培养在分别添加0.1 mg/L NAA、4 mg/L 6-BA的分化培养基上的茎尖分生组织，其植株再生率较其他处理最高，为97.78%（表2）。培养在不同处理的分化培养基上的郑红23号茎尖分生组织，均有较高的植株再生率，且差异不显著，说明添加这2种激素及不同质量浓度配比的分化培养基较适合郑红23号茎尖分生组织的植株再生。之后将再生植株转到MS基本培养基上，所有再生植株都发育成完整植株（图1-D）。

表2 不同分化培养基对郑红23号茎尖植株再生的影响Tab.2 Effect of different differentiation mediums on shoot apical plant regeneration of Zhenghong 23

2.2 郑红23号再生植株脱毒检测结果

2.2.1 PCR条带检 测取8μL的PCR扩增产 物在1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳后将胶块放置在凝胶成像仪上观察拍照，各种病毒（SPVG在再生植株中未检出）所显示目标条带在2 000 bp DNA Maker标准下与预期条带大小一致（图2）。

图2 SPLCV、SPCSV、SPFMV、SPLV、SPVG的PCR检测Fig.2 PCR detection of SPLCV，SPCSV，SPFMV，SPLV，and SPVG

之后的测序结果表明，扩增片段大小与预期的条带一致。所得序列与GenBank中其他分离的核苷酸序列同源性达99%以上，表明所得结果可靠。

2.2.2 再生植株平均脱毒率 在郑红23号茎尖分生组织的植株再生中，用PCR方法对郑红23号再生苗依次检测甘薯卷叶病毒、甘薯褪绿矮化病毒、甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒、甘薯病毒G，各处理的平均脱毒率较低，且差异显著，在添加0.1 mg/L NAA和4 mg/L 6-BA的分化培养基上，茎尖再生苗得到了最高的脱毒率，为13.60%（表3）。

表3 不同分化培养基对郑红23号再生苗5种病毒脱毒率的影响Tab.3 Effect of different differentiation mediums on virus-free rate of 5 viruses in regenerated seedlings of Zhenghong23

3 结论与讨论

有研究表明，甘薯茎尖分生组织的再生效果受NAA、6-BA等激素的影响较大[18]。董芳等[19]比较不同6-BA和NAA组合下茎尖成苗率，湘薯15号和湘薯19号的最佳植物激素配比分别为MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA和MS+2.0 mg/L 6-BA+0.67 mg/L NAA，成苗率分别为40.7%和57.8%。阮先乐等[20]通过对甘薯品种豫薯12的茎尖分生组织的研究，发现诱导豫薯12再生成苗的最佳培养基是MS+0.3 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，此时茎尖萌芽率为80.4%，成苗率为72.3%。许泳清等[21]研究发现，福薯604茎尖组培成苗的最佳培养基为MS+1.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3，其茎尖组培苗萌芽率为93.3%，成苗率为50.0%。邱鹏飞等[22]以烟薯26号和烟紫薯3号为试验材料，发现烟薯26号和烟紫薯3号较适宜的茎尖诱导培养基为MS+1.5 mg/L NAA，植株再生率分别为88%和80%。闫明明等[23]研究发现，脱毒甘薯一号在激素配比为MS+0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA时，脱毒试管苗的繁殖系数最高。谭冠宁等[24]以桂紫薯12号甘薯为试验材料，发现在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3的培养基中，丛芽增殖率最高，丛芽诱导率为44.4%。这说明茎尖苗在不同激素浓度配比和不同的甘薯种类下，再生率及生长速度存在较大的差异。而通过与前人研究的对比发现，本研究中郑红23号茎尖苗再生率比目前已报道的大部分研究中的甘薯茎尖苗再生率高。表明本研究设计的激素质量浓度配比较适合甘薯茎尖再生，且本研究3次重复所培养茎尖总数为630个，群体较大，所得结果比较可靠。

目前，茎尖分生组织培养是获取脱毒苗的主要手段，但在脱毒苗培育过程中，茎尖再生苗不一定是脱毒苗，需要对再生植株进行快速和准确的检测，因此，研究快速、确切地检测病毒的高效检测技术具有关键的作用。本研究用PCR方法检测了各处理再生植株的脱毒情况，各处理之间茎尖再生苗脱毒率存在差异。茎尖再生苗在激素配比为0.1 mg/L NAA与4 mg/L 6-BA的MS培养基处理中进行培养时，对5种病毒有最高的脱毒率，为13.60%，脱毒率偏低，这可能与所培养的茎尖大小、形态等有关；且不同的检测方法、检测仪器的灵敏度等也会造成脱毒率的不同。朱红彩等[25]研究发现，剥离的茎尖越小,所带病毒越少，获得无病毒植株的概率就越大，但诱导成活的难度大。李军等[26]研究发现，植物热处理结合茎尖培养脱毒要比单纯茎尖培养脱毒效果好。有研究报道，在茎尖分生组织中，病毒的复制会被高浓度的生长激素所抑制[27]，外源激素如何抑制病毒的复制还有待进一步研究。目前，在植物脱毒技术方面，已经从茎尖培养、热处理脱毒、病毒抑制剂处理等单一脱毒方法向多种方法结合使用发展。在今后的研究中，将会结合其他脱毒方法，逐步提高郑红23号再生植株的脱毒率，研究更加适宜郑红23号的高效脱毒技术，为郑红23号及其他甘薯品种的高效脱毒及生产应用等提供重要的理论与实践依据。

本研究通过设计不同质量浓度的NAA及6-BA配比，探讨适宜郑红23号的茎尖分生组织高效愈伤组织诱导和植株再生体系，并通过PCR方法对再生苗进行病毒病检测，结果表明，在NAA和6-BA激素处理下培养的郑红23号再生率均高于90%，且极显著高于空白对照，但各处理间的差异不显著。其中MS+0.1 mg/L NAA+4.0 mg/L 6-BA再生率最高，为97.78%，且该处理下脱毒率也最高，为13.6%。此外，MS+0.1 mg/L NAA+6.0 mg/L 6-BA的愈伤组织诱导率高达100%，该处理下的再生率和脱毒率分别为91.11%和11.79%。本研究旨在建立适宜甘薯郑红23号的高效脱毒技术体系，为郑红23号的健康脱毒种薯种苗繁育及绿色高效生产提供科学的技术支撑，但本研究中脱毒率还有待进一步提高。