董军立 贾诚谦 姚宪宝 苗二芽 蔡毅 杨夏晴

(华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院疼痛科,湖北 武汉 430014)

下腰痛的发病率随着人口老龄化的加剧逐渐上升，给人们的生活质量和社会医疗带来了极大的影响〔1〕。椎间盘退变是诱发下腰痛的重要原因，椎间盘包括外层的结缔组织和内层的髓核，髓核细胞的减少和过度凋亡可使椎间盘退变进程加快〔2,3〕。而髓核细胞内白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α等促炎因子的异常产生能够诱导细胞大量凋亡，进一步导致细胞内蛋白聚糖(aggrecan)和Ⅱ型胶原蛋白(collagen Ⅱ)的表达降低，从而加速椎间盘退变〔4,5〕。此外，自噬是一种分解代谢过程，可以通过降解溶酶体中的细胞内底物来应对缺氧、氧化应激和营养应激，从而维持细胞活力和稳态。自噬参与了椎间盘退变的发病机制，包括炎症刺激和细胞凋亡〔6〕。二甲双胍是广泛应用于Ⅱ型糖尿病临床治疗的双胍类药物，能够明显降低早期糖尿病患者发展成胰腺癌的风险。研究表明，二甲双胍不仅能通过蛋白磷酸酶(PP)2A/蛋白激酶B(Akt)通路抑制结直肠癌细胞增殖、诱导衰老〔7〕，也能通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)途径促进自噬、保护心肌细胞免受氧糖剥夺诱导的凋亡和损伤〔8〕，还能通过抑制Src/信号转导子和转录激活子(STAT)3通路诱导胃癌细胞凋亡〔9〕。然而，二甲双胍在人椎间盘髓核细胞中的作用尚不清楚。因此，本研究将使用IL-1β诱导人椎间盘髓核细胞，探讨二甲双胍对人椎间盘髓核细胞凋亡和自噬的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞及主要试剂、仪器 人椎间盘髓核细胞，由美国ScienCell公司提供；二甲双胍，购自武汉丰泰威远科技有限公司；Akt/糖原合成酶激酶(GSK)3β/β-连环蛋白(β-Catenin)通路抑制剂MK2206，购自上海芮晖化工科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)试剂及Lipofectamine 2000转染试剂，购自北京索莱宝公司；hochest 33258染色试剂盒，购自北京中科瑞泰生物科技有限公司；IL-1β、IL-6、TNF-α检测试剂盒，购自上海通蔚实业有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、促凋亡蛋白Bax、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、aggrecan、collagen Ⅱ、微管相关蛋白1轻链(LC)3B、自噬相关蛋白(p62、Atg7、Beclin1)、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β、β-Catenin抗体及相应二抗，购自北京百奥莱博科技有限公司。细胞培养箱，购自Bio-Rad公司；酶标仪，购自Thermo公司；流式细胞仪，购自美国Becton Dickinson公司。

1.2细胞培养及分组 人椎间盘髓核细胞复苏后，置于DEME培养基(含10%胎牛血清)上，37℃，在含5%二氧化碳的细胞培养箱中持续培养，待细胞融合至80%左右，加入适量胰蛋白酶进行消化，并传代培养。将第三代人椎间盘髓核细胞采用10 ng/ml IL-1β诱导，然后随机分组为IL-1β组、IL-1β+低浓度二甲双胍(40 μg/ml)组、IL-1β+中浓度二甲双胍(80 μg/ml)组、IL-1β+高浓度二甲双胍(160 μg/ml)组、IL-1β+高浓度二甲双胍+MK2206(10 μmol/L Akt/GSK3β/β-Catenin通路抑制剂MK2206〔10〕)组，上述各组分别于培养基中加入相应浓度试剂，另使用正常培养基培养人椎间盘髓核细胞作为Control组。

1.3MTT法检测细胞活性 在经过处理后的各组人椎间盘髓核细胞中分别加入10 μl MTT试剂，继续培养4 h，然后使用酶标仪检测各组人椎间盘髓核细胞在450 nm波长下的吸光度值。

1.4hochest 33258法检测细胞凋亡 将各组人椎间盘髓核细胞采用多聚甲醛进行固定，然后使用磷酸盐缓冲液进行清洗后，加入hochest 33258染色试剂，遮光反应5 min，在荧光显微镜下观察到的染色质浓缩和核碎裂突出的为凋亡细胞，呈现亮蓝色，而正常细胞核表现为淡蓝色。含有凋亡细胞核的细胞数与细胞总数的百分比为细胞凋亡率。

1.5酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子水平 将各组人椎间盘髓核细胞进行消化、裂解、离心后，收集上清液，使用ELISA检测IL-1β、IL-6、TNF-α水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.6GFP-LC3质粒转染法检测细胞自噬水平 各组人椎间盘髓核细胞清洗后，将GFP-LC3质粒利用Lipofectamine 2000转染试剂转染至人椎间盘髓核细胞，24 h后，弃去培养基，按照1.2的方法处理各组细胞，过夜培养后进行清洗、固定，然后加入二脒基苯基吲哚(DAPI)，在37℃下静置染色10 min，对激光共聚焦显微镜下观察到的自噬体(一个绿色荧光斑点为一个自噬体)进行拍照并计数。

1.7Western印迹检测细胞蛋白表达水平 提取各组人椎间盘髓核细胞总蛋白，取适量蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜后封闭1 h，加入稀释过的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶caspase-3、Bax、Bcl-2、aggrecan、collagen Ⅱ、LC3B、p62、Atg7、Beclin1、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β、β-Catenin抗体，继续孵育24 h，然后加入对应的二抗稀释液，1.5 h后进行显色反应并分析其蛋白表达水平。

1.8统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验和单因素方差分析。

2 结 果

2.1二甲双胍对各组人椎间盘髓核细胞活性的影响 与Control组〔(100.00±2.14)%〕相比，IL-1β组人椎间盘髓核细胞活性〔(41.25±1.23)%〕显著下降(P<0.05)；IL-1β+低浓度二甲双胍组〔(53.06±1.45)%〕、IL-1β+中浓度二甲双胍组〔(67.89±1.77)%〕、IL-1β+高浓度二甲双胍组〔(79.68±1.84)%〕人椎间盘髓核细胞活性显著高于IL-1β组(P<0.05)，且呈浓度依赖性；而与IL-1β+高浓度二甲双胍组比较，IL-1β+高浓度二甲双胍+MK2206组人椎间盘髓核细胞活性〔(44.51±1.36)%〕明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2二甲双胍对各组人椎间盘髓核细胞凋亡的影响 Control组人椎间盘髓核细胞的细胞核被染成淡蓝色；IL-1β组大部分细胞核被染成亮蓝色，细胞凋亡率相比Control组显著升高，caspase-3、Bax蛋白表达水平明显升高，Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；与IL-1β组相比，IL-1β+低浓度二甲双胍组、IL-1β+中浓度二甲双胍组、IL-1β+高浓度二甲双胍组细胞凋亡率依次降低，caspase-3、Bax蛋白表达水平依次下降，Bcl-2蛋白表达水平依次升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与IL-1β+高浓度二甲双胍组比较，IL-1β+高浓度二甲双胍+MK2206组细胞凋亡率显著升高，caspase-3、Bax蛋白表达水平显著升高，Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，见图1、表1、图2。

2.3二甲双胍对各组人椎间盘髓核细胞炎性因子的影响 IL-1β组人椎间盘髓核细胞中IL-6、TNF-α表达量显著高于Control组(P<0.05)；与IL-1β组相比，IL-1β+低浓度二甲双胍组、IL-1β+中浓度二甲双胍组、IL-1β+高浓度二甲双胍组人椎间盘髓核细胞中IL-6、TNF-α表达量呈浓度依赖性降低(P<0.05)；而与IL-1β+高浓度二甲双胍组比较，IL-1β+高浓度二甲双胍+MK2206组人椎间盘髓核细胞中IL-6、TNF-α表达量显著升高(P<0.05)。见表2。

图1 各组人椎间盘髓核细胞凋亡(hochest 33258,×200)

表1 二甲双胍对各组人椎间盘髓核细胞凋亡的影响

1～6:Control组、IL-1β组、IL-1β+低浓度二甲双胍组、IL-1β+中浓度二甲双胍组、IL-1β+高浓度二甲双胍组、IL-1β+高浓度二甲双胍+MK2206组；图3、5、6同图2 各组人椎间盘髓核细胞凋亡相关蛋白表达比较

2.4二甲双胍对各组人椎间盘髓核细胞aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表达的影响 与Control组比较，IL-1β组人椎间盘髓核细胞中aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表达水平显著下降(P<0.05)；与IL-1β组相比，IL-1β+低浓度二甲双胍组、IL-1β+中浓度二甲双胍组、IL-1β+高浓度二甲双胍组人椎间盘髓核细胞中aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，且IL-1β+低浓度二甲双胍组

表2 二甲双胍对各组人椎间盘髓核细胞炎性因子及aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表达的影响

2.5二甲双胍对各组人椎间盘髓核细胞自噬的影响 Control组呈现极少的点状聚集的自噬体；与Control组相比，IL-1β组人椎间盘髓核细胞自噬体数明显增加，LC3B、Atg7、Beclin1蛋白表达水平明显升高，p62蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；与IL-1β组相比，IL-1β+低浓度二甲双胍组、IL-1β+中浓度二甲双胍组、IL-1β+高浓度二甲双胍组人椎间盘髓核细胞自噬体数依次减少，LC3B、Atg7、Beclin1蛋白表达水平依次降低，p62蛋白表达水平依次升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；而与IL-1β+高浓度二甲双胍组比较，IL-1β+高浓度二甲双胍+MK2206组人椎间盘髓核细胞自噬体数明显增加，LC3B、Atg7、Beclin1蛋白表达水平明显增加，p62蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，见图4、表3、图5。

图3 各组人椎间盘髓核细胞aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表达比较

图4 各组人椎间盘髓核细胞自噬(DAPI，×200)

2.6二甲双胍对各组人椎间盘髓核细胞Akt/GSK3β/β-Catenin信号通路的影响 IL-1β组人椎间盘髓核细胞p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值明显低于Control组，β-Catenin蛋白表达水平明显高于Control组(P<0.05)；与IL-1β组相比，IL-1β+低浓度二甲双胍组、IL-1β+中浓度二甲双胍组、IL-1β+高浓度二甲双胍组人椎间盘髓核细胞p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值依次升高，β-Catenin蛋白表达水平依次降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；IL-1β+高浓度二甲双胍+MK2206组人椎间盘髓核细胞p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值明显低于IL-1β+高浓度二甲双胍组，β-Catenin蛋白表达水平明显高于IL-1β+高浓度二甲双胍组(P<0.05)，见图6、表4。

表3 二甲双胍对各组人椎间盘髓核细胞自噬的影响

图5 各组人椎间盘髓核细胞自噬相关蛋白表达比较

图6 各组人椎间盘髓核细胞Akt/GSK3β/β-Catenin信号通路蛋白表达比较

表4 二甲双胍对各组人椎间盘髓核细胞Akt/GSK3β/β-Catenin信号通路的影响

3 讨 论

研究〔11〕发现，椎间盘退变的影响因素甚多，主要包括年龄、压力等外界因素及遗传、氧化应激、炎症因子等内在因素，其作用机制十分复杂。目前主要通过药物治疗和外科手术来治疗椎间盘退变疾病，但并不能从根源上消除患者的病痛〔12〕。

研究〔13〕表明，髓核细胞的活性降低与凋亡增加是诱发椎间盘退变的重要原因。IL-1β是研究较为广泛的促炎因子。Zhu等〔14〕研究发现，IL-1β能诱导髓核细胞凋亡，同时促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase 3表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调。Liu等〔15〕研究发现，IL-1β诱导抑制aggrecan、collagen Ⅱ表达，促进IL-6、TNF-α表达。而当且椎间盘发生退变时，其髓核细胞内的aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表达降低。本研究通过IL-1β诱导人椎间盘髓核细胞发现，IL-1β可抑制人椎间盘髓核细胞增殖，诱导凋亡和炎症反应，加快椎间盘退变进程。二甲双胍已被证实能够通过调控相关蛋白表达抑制宫颈癌〔16〕、结肠癌〔17〕、胃癌〔18〕细胞增殖、促进凋亡。本研究结果说明二甲双胍能够促进IL-1β诱导的人椎间盘髓核细胞增殖，抑制其凋亡和炎症反应，并减缓椎间盘退变进程。

自噬是细胞程序性死亡的一种方式，可与凋亡协同作用加速肿瘤细胞死亡。同时，自噬也是一种重要的细胞内分解代谢过程，在炎症、营养剥夺和应激条件下，通过降解和回收受损成分、有毒蛋白质和细胞器，有助于细胞内质量控制和维持细胞生存〔19〕。自噬降解凋亡蛋白来调节各种疾病的进展，如癌症、神经退行性疾病〔20〕和骨关节炎〔21〕。正常情况下，自噬对细胞有保护作用，但过度自噬会导致细胞死亡。研究〔22〕表明，LC3B、Atg7、p62、Beclin1是自噬标志蛋白，细胞受到刺激发生损伤时会增加其自噬水平，进一步提高LC3B、Atg7、Beclin1表达并降低p62表达。Saladini等〔23〕研究发现，二甲双胍能够通过抑制自噬发挥抗乳腺癌和宫颈癌的作用。然而，二甲双胍在人椎间盘髓核细胞自噬中的作用仍不清楚。本研究结果提示二甲双胍对IL-1β诱导的人椎间盘髓核细胞自噬有保护作用。

已有研究〔24〕表明，前叶素能够通过激活Akt/GSK3β/β-Catenin途径促进成骨，抑制破骨细胞分化。通过激活PI3K/AKT信号通路增强椎间盘退变细胞自噬，可显著降低IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平，抑制衰老和细胞凋亡〔20，25〕。MK2206是Akt抑制剂，会致使Akt及其下游基因GSK3β磷酸化水平降低，同时使β-Catenin表达升高〔26〕。本研究发现，IL-1β诱导后人椎间盘髓核细胞Akt、GSK3β磷酸化水平显著降低，β-Catenin蛋白表达水平明显升高；低、中、高浓度二甲双胍能够使人椎间盘髓核细胞Akt、GSK3β磷酸化水平依次升高，β-Catenin蛋白表达水平依次降低；而MK2206的加入则能使Akt、GSK3β磷酸化、β-Catenin蛋白表达水平得到逆转。此外，抑制Akt/GSK3β/β-Catenin通路会逆转二甲双胍对人椎间盘髓核细胞增殖、凋亡、炎症因子及自噬的调控作用。揭示，二甲双胍能够通过激活Akt/GSK3β/β-Catenin信号通路促进IL-1β诱导的人椎间盘髓核细胞增殖、抑制凋亡、自噬。

综上所述，二甲双胍可促进IL-1β诱导的人椎间盘髓核细胞增殖并抑制其凋亡、炎症反应及自噬，进而减缓椎间盘退变进程，其机制与Akt/GSK3β/β-Catenin信号通路的激活有关，二甲双胍有望成为治疗椎间盘退变疾病的靶向药物。