朱雯君，窦君霞，郑文轩，梅丽华，孟宁，于晓涵，韩坤宸，马金克，李锐定，李全阳,

（1.广西大学轻工与食品学院，广西南宁 530004；2.泰山职业技术学院生物技术工程系，山东泰安 271000）

从健康走向衰老是生物体都会经历的复杂过程。促成衰老的诸多复杂因素可归结为内部个体遗传因素和外部环境因素，而饮食则被认为是关键的环境因素之一。饮食中的蛋白质营养能够通过调节机体总能量摄入、生长发育、肥胖以及代谢疾病的发生，影响机体的健康状况，因而受到研究者们的广泛关注。已有研究证明利用饮食中不同的蛋白质营养方式对动物及人体进行干预具有调节血糖、改善生殖状态、降低疾病发病率以及促进代谢健康等功效。此外，相关研究表明，通过调节蛋白质与碳水的比例能够有效促进健康长寿。Le Couteur 等通过小鼠实验证明了低蛋白高碳水饮食与健康长寿有关；Dorling 和Caro 等发现低蛋白质高碳水化合物、以及低脂肪饮食能够改善小鼠的健康，延长其寿命；Richardson 等发现在早衰小鼠中，限制饮食中的支链氨基酸水平能够促进代谢健康，并且在生命之初就遵循这种饮食方式的雄性小鼠寿命延长了30%。以上研究表明，调节饮食中蛋白质与碳水化合物的摄入比例可作为促进健康长寿的一种干预措施。

虽然高蛋白饮食可用于实现减肥并改善肌肉功能和质量，但有研究发现高蛋白质饮食会给疾病风险人群带来许多不良效果。长期蛋白质摄入过多，会产生有害的含氮废物，造成肾脏负担。有综述性研究提出，降低蛋白质消耗量与更低的死亡率和糖尿病发病率有关。并且越来越多前瞻性临床试验表明，高蛋白饮食可能与胰岛素抵抗、糖尿病、肥胖和高死亡率之间存在关联。因此关于饮食中蛋白质的营养方式仍然是个具有争议的问题。这些研究体现了蛋白质营养方式的重要性，但没有提及以长寿为导向的蛋白质营养理想模式。

广西长寿地区具有独特的饮食模式，该地区的长寿现象与其日常饮食密不可分。课题组前期调查研究发现，广西饮食模式具有明显的低蛋白含量的特征，该饮食模式当中蛋白质和碳水化合物比例为1:4。对该饮食模式进一步调查分析，探索动物在长寿饮食模式指导下的蛋白质营养方式的健康状况，也许有助于理解该蛋白质营养方式在健康长寿中扮演的角色。为此本研究将分析借鉴广西长寿老人饮食热量和营养素供应比例，以该长寿饮食模式下的蛋白质供给方式为干预因子。在保持各试验组热量和脂肪摄入稳定基础上，以梯度扩大研究范围，将小鼠饮食中蛋白质和碳水化合物的比例作为调控方法，设计不同的蛋白质营养饲喂方式，探究长寿饮食模式指导下的低蛋白质饮食对抗衰老的作用，以期为长寿饮食模式下的蛋白营养方式提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

72 只8 周龄C57/BL 小鼠（雌雄各半）北京斯贝福生物技术有限公司（试验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010，试验动物伦理审查批准号：2022-GXU-009）；标准饲料、试验组饲料 符合GB 14924.3-2010《试验动物配合饲料营养成分》并按照要求的营养成分配比制造，江苏协同生物有限公司；D-半乳糖 上海麦克林生物科技有限公司；50%葡萄糖饮品 吉林天瑞生物科技有限公司；4%多聚甲醛 赛国生物科技有限公司；MDA 试剂盒、TAOC 试剂盒、HE 染色液 南京建成生物工程研究所；4%多聚甲醛 河北博海生物工程开发有限公司。

Morris 水迷宫设备 上海欣软信息科技有限公司；Pico17 低温冷冻离心机 美国Thermo 公司；立式高压灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司；超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；TG16W 微量高速离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司；DNP-9082BS电热恒温培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；CKX41 倒置显微镜 日本Olympus 公司；Leica EG1160 石蜡包埋机、Leica 1020 自动脱水机、Leica RM2235 石蜡切片机 德国Leica 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 饲料设计与制备 本试验在前期研究的基础上，在控制能量不变的情况下结合GB14924.3-2010，以Ain93 标准饲料为基底，以玉米淀粉、麦芽糊精、酪蛋白、L-胱氨酸、蔗糖、纤维素、猪油、混合维生素V10037、混合矿物质S10022G、酒石酸氢胆碱为配置原料，分别制成脂肪均占热量供能比25%，蛋白质与碳水化合物供能比（protein/carbohydrate）分别为P/C=1/2 的高蛋白饲料（P 供能25%，C 供能50%），P/C=1/3 中蛋白饲料（P 供能18.75%，C 供能56.26%），P/C=1/4（P 供能15%，C 供能60%）和P/C=1/5（P 供能12.5%，C 供能62.5%）的低蛋白饲料的四种试验组饲料。

1.2.2 动物分组及处理 72 只8 周龄小鼠适应性喂养一周后，随机分为6 组，雌雄各半，每组12 只。分别为：D-gal+P/C=1/2 组、D-gal+P/C=1/3 组、D-gal+P/C=1/4 组、D-gal+P/C=1/5 组、衰老对照组、年轻对照组。在试验期间，每只小鼠每日颈背部皮下注射150 mg/kg 的D-gal 溶液8 周，年轻对照组小鼠不间断每日颈背部皮下注射8 周相应体积的生理盐水。D-gal 的注射剂量和时间参考多篇文献确定。于SPF 级动物房饲养试验小鼠，昼夜12/12 h 循环光照，环境温度（22±1）℃，相对湿度60%，自由饮水饮食，每7 d 记录一次体重，造模的同时，每只小鼠以3 g 为基准，不同试验组投喂对应饲料。

1.2.3 Morris 水迷宫试验 Morris 水迷宫系统是由一个高50 cm、直径为120 cm 的圆形水池及一个平台、自动图像采集和处理系统组成的测试设备，广泛应用于研究与空间学习和记忆相关的大脑区域的功能评价，水迷宫试验于饮食干预开始后第8 周开始，方法参照[23−24]文献进行。整个实验为期6 d，试验前5 d 进行定位航行试验，第6 d 进行空间探索试验。定位航行测试是对小鼠水迷宫学习和信息记忆能力的获取水平衡量，每天训练4 次，使小鼠分别从四个象限的入水点处面朝池壁进入水中，追踪小鼠从触水至找到并站立于水中隐蔽的平台之上所用的时长，即逃避潜伏期，若小鼠入水后历时60 s 未找到平台，则将小鼠从水中缓缓拉上平台，让其在平台上观察学习10 s，准备进行下一次训练；追踪和记录其潜伏期，空间探索试验是测试小鼠在学习寻找平台5 d后，将隐藏在水下的平台撤掉，所有小鼠固定从任意选择的同一入水点进入水中，追踪其在原平台位置停留的时间和穿越原平台所在区域的次数。

1.2.4 抗氧化指标的测定 行为学试验结束之后，所有小鼠禁食但不禁水12 h，称量并记录体重，乙醚麻醉后，眼球取血，于冰上解剖迅速取出肝组织，在9%生理盐水中漂洗，经滤纸吸干残余水分，称重后记录数据，并迅速保存于−80 ℃冰箱。测定当天，取出肝组织，准确称取检测所需组织重量，加入重量4 倍体积的生理盐水，在冰水浴中机械匀浆，制得肝组织匀浆液，4 ℃、12000 r/min 条件下离心5 min，取上清液测定MDA 和T-AOC 含量。

1.2.5 脑组织切片 同上操作取得全脑，称重后固定在4%多聚甲醛中24 h 以上，脱水处理并以软、硬石蜡进行包埋，接着用石蜡切片机对样品切片，在水浴锅中展片，再用苏木素-伊红染液染色，脱水后中性树胶封片，CKX41 倒置显微镜（400×）观察HE 染色显示的海马区形态学特征。

1.2.6 健康综合指数评分方法建立 主成分分析是对多个变量间相关性进行考察的一种多元统计方法，将原来众多具有一定相关性的指标降维处理成一组新的无相关性的综合指标的数据分析方法。通过分析具体情况，本研究选取了T-AOC、MDA、体重变化量及目标象限停留的时间这4 种指标，采用主成分分析法对各项指标进行评分，以精确反映每项指标对健康的影响作用效果，形成CHS。具体做法是首先利用R 语言的SCALE 函数对研究所得数据进行标准化，然后进行主成分分析，主成分分析结果假设如表1 所示：

表1 主成分分析结果Table 1 Principal component analysis results

累积解释度达到85%（假设m>0.85）即为最适宜，进而确定主成分数。则CHS 公式如下：

式中：x表示各试验组小鼠指标进行标准化后的取值；a为各组第一主成分值；b为各组第二主成分值；c为各组第三主成分值d为各组第四主成分值；v为样本在各主成分的方差解释度；m为样本在个各主成分下的累计方差解释度。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 广西长寿饮食模式下的蛋白质营养方式对Dgal 致衰老小鼠体质量的影响

体重作为衡量机体生长的一项指标，常用于反映机体的健康状况。由表2 可知，试验进行8 周后，各组小鼠体重均有不同程度上升，其中衰老对照组和年轻对照组体重增加量最多，分别增加了2.11和2.26 g（<0.05），可能是由于衰老对照组代谢减缓，未消耗的热量储存在小鼠体内导致体重上升，年轻对照组小鼠代谢高食欲好，导致体重增加较多。高蛋白饮食组P/C=1/2 组和中蛋白饮食组P/C=1/3 组小鼠体重分别增加了1.72 和0.58 g。两组低蛋白饮食P/C=1/4 组和P/C=1/5 组小鼠随着饮食中碳水化合物比例的上升体重也增加，分别为0.68 和1.45 g（<0.05）。说明广西长寿饮食模式下的P/C=1/4 低蛋白饮食对D-半乳糖致衰老模型小鼠的生长发育没有不良影响，没有导致体重下降和营养不良，且相对高蛋白饮食会减缓体重增加，导致维持小鼠体重稳定的良好效果。各组间初始体重无显著差异，组间最终体重差异也不显著。Simpson 等发现当蛋白质过低时，小鼠会出现补偿性饮食行为，即出现类似暴食的行为，用增加摄食总量来满足所需的蛋白质，同时高碳水饮食也意味着更高热量，本研究认为P/C=1/5饮食组小鼠体重上升较多为同样原因。

表2 广西长寿饮食模式下的蛋白质营养方式对D-gal 致衰老小鼠体质量的影响Table 2 Effects of protein nutrition strategy under Guangxi longevity diet pattern on body weight of D-gal induced aging mice

2.2 广西长寿饮食模式下的蛋白质营养方式对Dgal 致衰老小鼠学习记忆能力的影响

表3 显示在5 d 定位航行试验中，各组小鼠逃避潜伏期的变化情况。第1 d 定位航行试验当中，衰老对照组逃避潜伏期时间最长。各组小鼠的逃避潜伏期随着训练时间延长均明显缩短，但衰老对照组小鼠第5 d 的逃避潜伏期仍然较长，第5 d 与第1 d 对比，衰老对照组逃避潜伏期缩短125.75%，年轻对照组逃避潜伏期缩短193.49%，P/C=1/2 组和P/C=1/3 组逃避潜伏期分别缩短173.50%和148.51%（<0.05）。低蛋白饮食P/C=1/4 组和P/C=1/5 组分别缩短232.05%和180.16%（<0.05），接近于年轻对照组。逃避潜伏期下降程度大于衰老对照组。张丹丹等研究发现，连续42 d 腹腔注射40 mg/kg 大蒜素使D-半乳糖衰老模型小鼠的逃避潜伏期下降了98.68%。相比较而言，本研究中广西长寿饮食模式下的低蛋白饮食组下降程度更大些，低蛋白饮食P/C=1/4 组和P/C=1/5 组进步为明显，说明该组小鼠学习记忆能力突出。表明广西长寿饮食模式下的较低蛋白饮食结构具有改善学习记忆的能力。

表3 广西长寿饮食模式下的蛋白质营养方式对D-gal 致衰老小鼠在水迷宫中逃避潜伏期的影响Table 3 Effect of protein nutrition strategy under Guangxi longevity diet pattern on escape latency in D-gal induced aging mice in water maze

各组小鼠在平台象限内的运动情况路线见图1。可以明确看出年轻对照组小鼠有向目标象限运动的趋势，且相比衰老对照组在目标象限稍有停留，并穿越了平台。与年轻对照组相比，低蛋白饮食组P/C=1/4 组与P/C=1/5 组小鼠多在目标象限内运动，且在目标象限内运动的路程和停留时间更长，穿越平台次数更多。此外，P/C=1/4 组小鼠穿越平台次数比P/C=1/5 组略多。衰老对照组小鼠入水后仅围绕入水象限运动，没有穿过平台，在目标象限内的运动路程和停留时间均低于实验组，表明衰老对照组小鼠在前5 d 的定位航行试验中强化学习记忆的效果较差。与衰老对照组相比，P/C=1/2 组和P/C=1/3 组小鼠在目标象限内的运动路程和停留时间都有所增加，且多次穿越平台，但低于低蛋白饮食组P/C=1/4 组与P/C=1/5 组。说明低蛋白饮食对改善衰老小鼠的学习记忆能力有效果。有关量化统计结果见图2。

图1 空间探索试验各组小鼠典型路线Fig.1 Typical routes of mice in each group in the space exploration experiment

图2 广西长寿饮食模式下的蛋白质营养方式对D-gal 致衰老小鼠水迷宫试验的影响Fig.2 Effect of Guangxi longevity diet pattern on water maze test of D-gal induced aging mice

由图2 可知，与年轻对照组相比，衰老对照组小鼠逃避潜伏期较长、穿越平台次数、目标象限停留时间及目标象限路程均有所下降（<0.05）。与衰老对照组相比，低蛋白饮食P/C=1/4 组逃避潜伏期显著下降101.13%（<0.05），该组穿越平台次数、目标象限停留时间和目标象限运动路程分别提高了98.16%、170.27%和98.30%（<0.05）。高蛋白饮食组P/C=1/2 组和中蛋白饮食组P/C=1/3 组与衰老对照组相比，逃避潜伏期均有缩短，其中P/C=1/2 组有显著性差异；目标象限停留时间、穿越平台次数也均有增加，但无显著性差异（>0.05）；目标象限路程增加，其中P/C=1/2 组具有显著性差异（<0.05）。低蛋白饮食组P/C=1/5 组小鼠逃避潜伏期与衰老对照组相比缩短31.38%（>0.05），穿越平台次数和目标象限停留时间以及目标象限运动路程均低于其他试验组。因此认为本试验的P/C=1/4 组低蛋白饮食结构能够较好地维持小鼠的学习记忆能力，并有效逆转了衰老小鼠学习记忆能力下降的程度，还发现当饮食中蛋白质比例过低，达到P/C=1/5时，小鼠的认知能力没有提升反而减退。

小鼠的学习记忆能力常用Morris 水迷宫试验进行评价，王兴会等研究发现连续4 周低脂饮食，能够使定位航行试验中的大鼠逃避潜伏期比正常饮食组缩短46.24%。陈克成等探究发现，连续6 周皮下注射100 mg/kg 鹿脑小分子活性肽使D-半乳糖衰老模型小鼠的穿越平台次数上升49.72%。胡祖林等连续8 周摄入20 g/kg 的血人参提取物，发现D-半乳糖衰老模型小鼠的逃避潜伏期比模型组下降了48.67%。本研究中P/C=1/4 组经过连续8 周的饮食干预后显著缩短了小鼠的逃避潜伏期（<0.05），提升了穿越平台次数，目标象限停留时间和运动路程。比较而言，本研究的饮食干预不需要控制摄食量，易于实施且效果显著，因此在对提高衰老小鼠学习记忆能力方面具有一定的比较优势。

2.3 广西长寿饮食模式下的蛋白质营养方式对Dgal 致衰老小鼠肝组织抗氧化指标的影响

各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成的总体抗氧化水平可用T-AOC 水平体现，可反映机体清除活性氧的能力。从图3A 可以看出，衰老对照组肝脏TAOC 水平显著低于年轻对照组（<0.05）。低蛋白饮食P/C=1/4 组和P/C=1/5 组肝脏T-AOC 水平与衰老对照组相比，分别升高224.82%和172.26%（<0.05），与年轻对照组相比，分别升高85.41%和55.42%（<0.05）。高（P/C=1/2）、中（P/C=1/3）蛋白饮食组肝脏T-AOC 水平相对衰老对照组有显著上升，分别为91.06%和102.19%（<0.05），与年轻对照组相比肝脏T-AOC 水平有上升，但不显著（0.05）。温奇龙等研究发现连续灌胃35 d 2.1 mg/mL 扶芳藤总三萜使致衰小鼠肝组织中T-AOC 含量提高87.23%（<0.05）。邓洋等报道连续6 周灌胃剂量为10 g/kg的苦荞茶能使D 半乳糖致衰老模型小鼠肝组织的T-AOC 水平显著上升181%。基于此，相比之下，认为本研究的蛋白营养施策方式能够较好地减轻D-半乳糖诱导的肝脏氧化损伤，也较好地维持了机体内环境活性氧的动态平衡。

图3 广西长寿饮食模式下的蛋白质营养方式对D-gal 致衰老小鼠肝组织T-AOC 水平、MDA 含量的影响Fig.3 Effects of protein nutrition strategy under Guangxi longevity diet pattern on MDA content of T-AOC level in D-gal induced aging mice liver

MDA 是体内脂质D-gal 过氧化的代谢产物，含量过高会加剧细胞膜损伤，MDA 含量的高低直接反映了机体脂质过氧化水平。由图3B 可知，与年轻对照组相比，衰老对照组小鼠肝组织MDA 含量显著上升129.81%（<0.05），表明致衰老小鼠机体内的脂质过氧化水平升高。低蛋白饮食P/C=1/4 组和P/C=1/5 组与衰老对照组相比肝组织MDA 含量均有明显的下降，分别为213.33%和129.09%，与年轻对照组相比肝组织MDA 含量均有一定程度的下降，但不显著。低蛋白饮食P/C=1/4 组与高蛋白饮食P/C=1/2 组相比肝组织MDA 含量显著下降了108.60%（<0.05）。据报道，连续灌胃42 d 200 mg/kg 芜菁中性多糖使D-半乳糖（D-gal）致衰老模型小鼠肝组织中MDA 含量下降93.27%。连续49 d 灌胃50 mg/kg维生素E 使D-半乳糖所致小鼠衰老模型小鼠肝组织中MDA 含量下降103.82%，均低于本研究中低蛋白饮食组的效果。表明较低低蛋白饮食可降低Dgal 致衰老小鼠肝组织脂质过氧化水平，尤其在P/C=1/4 组中脂质过氧化水平降低的效果更加明显。

2.4 广西长寿饮食模式下的蛋白质营养方式对Dgal 致衰老小鼠海马区的保护作用

海马区是脑组织边缘系统的一部分，直接参与学习记忆过程。CA1 区与海马区生理功能的发挥密切相关，对外界病理因素最为敏感，也是病理变化最早出现的部位，所以海马CA1 区常作为脑损伤研究的一个典型区域。图4 是本试验小鼠海马区域的切片显微结构，观察海马切片图可知，年轻对照组海马CA1 区锥体细胞有3～4 层，排列整齐，细胞形态完整，核仁清晰。与年轻对照组相比，低蛋白饮食P/C=1/4 组小鼠海马CA1 区锥体细胞有5～6 层，排列更为紧密整齐，细胞形态和结构较完整，核仁清晰，神经细胞数量增多，细胞凋亡及核固缩现象极少。衰老对照组海马CA1 区锥体细胞排列相对疏松散乱，层次不清，且锥状体细胞明显较少。与衰老对照组相比，高蛋白饮食组P/C=1/2 中蛋白饮食组P/C=1/3 小鼠以及低蛋白饮食P/C=1/5 海马CA1 区锥体细胞排列整齐，细胞形态结构较完整，边界清晰，少见核固缩，海马CA1 区锥体细胞有3～4 层，状态更接近年轻对照组，但未见如P/C=1/4 组一样的明显锥状体细胞丰富状态。陈燏发现活性肽-N 对减缓衰老小鼠海马CA1 区细胞神经元变性、坏死和凋亡的发生起到了有效的作用。比较而言，广西长寿饮食模式下的蛋白质营养方式也具有预防衰老小鼠脑组织海马区损伤的作用。

图4 广西长寿饮食模式下的蛋白质营养方式对D-gal 致衰老小鼠海马区的影响（400×）Fig.4 Effects of protein nutrition strategy under Guangxi longevity diet pattern on hippocampus of D-gal induced aging mice（400×）

2.5 综合评定不同蛋白质营养方式对试验动物衰老状况的影响作用

为了能够综合性地、量化地表征不同蛋白质营养方式对试验动物衰老状况的影响作用，根据多元统计分析理论，提出用主成分分析方法对上述各组试验动物的检测结果进行综合评价，结果见表4。

以表4 所得结果，通过公式1，求得各试验组各小鼠样本（以S表示）综合健康评分（CHS），具体结果见表5。

表4 主成分分析结果Table 4 Principal component analysis results

由表5 结果可知，本研究通过主成分分析、综合健康评分等分析手段，量化表征出了每组小鼠健康状况的具体优劣程度。取各组的CHS 均值，这个均值就可以体现不同组别的总体健康水平，比较其数值大小就能够给出优劣顺序，这样6 组试验动物的综合健康指数均值由高到低的排序为：P/C=1/4 组>P/C=1/5 组>P/C=1/3 组>年轻对照组>P/C=1/2 组>衰老对照组（见表5）。分析还发现，在食物中蛋白质比率由高到低的变化过程中，试验鼠的综合健康评分均值有一个由逐步升高，之后达到峰值，而后降低的变化规律。P/C=1/2 和P/C=1/3 饮食组的小鼠单项指标和综合健康评分均值逐渐上升，在P/C=1/4 时达到最高峰值，P/C=1/5 组的综合健康评分均值又落后于P/C=1/4 组，有一个逐渐下降的情况，反观最高峰值P/C=1/4 的状态所对应的具体指标，发现此时试验鼠体质量维持相对稳定（表2），在水迷宫中逃避潜伏期最短（图2），提示该组试验鼠具备较好的学习记忆能力；该组的T-AOC 水平最高且MDA 含量下降明显（图3），说明该比例下的低蛋白质饮食干预能有效抑制脂质过氧化水平，维持机体健康；该组的海马区细胞核仁清晰，保持了完整的结构形态，神经细胞数量增多也说明了小鼠脑健康状态良好（图4）。

表5 各试验组小鼠健康综合评分（CHS）结果Table 5 Comprehensive health score of experimental mice groups

3 结论

本研究设计了4 种比例的蛋白质营养方式，采用D-gal 致衰老小鼠进行了对比探究，结果发现广西长寿饮食模式下的低蛋白饮食P/C=1/4 组小鼠体重维持相对稳定，水迷宫试验显示该组的小鼠学习记忆能力最好，肝组织T-AOC 活力、MDA 含量的测定结果也表明，低蛋白饮食P/C=1/4 组的饮食对小鼠抗衰老效果最好，脑切片研究显示低蛋白饮食P/C=1/4组饲料对D-gal 致衰老小鼠海马CA1 区的保护作用优于高（P/C=1/2）、中蛋白饮食组（P/C=1/3）或低蛋白饮食P/C=1/5 组。综合研究结果，构建综合健康评分，表明随着蛋白质与碳水化合物的比例下降，各指标呈现逐步趋优然后达到峰值，而后又出现劣化的特征。还发现当P/C=1/4 时，抗衰老效果最优（综合健康评分均值最高）。研究成果将对丰富人体膳食的营养理论、促进饮食健康和长寿具有一定的帮助。