潘忠梅，陈兴江，孙光军，何世芳，陆 宁，桑维钧，曹 毅*

（1贵州省烟草科学研究院，贵州贵阳 550081；2贵州大学烟草学院，贵州贵阳 550025；3中国烟草总公司贵州省公司，贵州贵阳 550004）

0 引言

【研究意义】烟草（L.）为茄科双子叶植物，是我国重要的经济作物之一。贵州烟草种植历史悠久，为全国第二大植烟区（闫新甫等，2021），是烟农脱贫的重要支柱产业。烤烟以收获叶片为主，叶部类病害严重损害其经济效益。烟草蛙眼病主要为害烟草大田时期的成熟叶片，症状表现为圆形或不规则的褐色小斑块，中心白色，边缘暗褐色（Shamarao and Hundekar，2010；Zhao et al.，2020），由下部叶向中上部叶蔓延流行（刘爱民和何录秋，2000）。近年来，烟草蛙眼病在贵州分布范围和危害有扩大和上升趋势，病叶采收烘烤后褐色斑点明显，造成产质量下降。因此，明确贵州省烤烟蛙眼病病原菌种类及生物学特性，对病害的有效防治及抗病品种的选育等具有重要意义。【前人研究进展】烟草蛙眼病最早于1893年在美国的北卡罗来纳州报道，后在1929年南非和1936年澳大利亚也发生为害（朱贤朝等，2001）。目前，对烟草蛙眼病的研究仅有少量报道。研究发现，引起云南、湖南、山东和海南烟草蛙眼病的致病菌为烟草尾孢（）（范静华和陈海如，1994；何可佳等，1996；Li et al.，2016；Zhao et al.，2020）。范静华和陈海如（1994）对分离自云南的烟草蛙眼病菌研究结果显示，病原菌生长最适温度为27 ℃，致死温度为63 ℃水浴10 min，最适pH 4～5；而何可佳等（1996）对分离自湖南的烟草蛙眼病菌研究发现病原菌最适生长温度为25～30 ℃，致死温度为55 ℃水浴10 min，pH 5～10生长良好，最适碳氮源为蔗糖和L-天冬酰胺。可见，同种病害不同地区分离出的病原菌生物学特性存在差异（廖映凯等，2021）。如香蕉棒孢霉叶斑病病原菌与不同寄主作物来源的多主棒孢菌菌株间的生物学特性存在明显差异（番华彩等，2018）；花椒流胶病病原菌小穴壳菌属适宜在中性和弱碱性环境生长（王秀娟等，2019），与高新明（2011）小穴壳菌属以酸性生长条件较佳的研究结果相反；邵慧慧等（2022）认为，西洋参锈腐病病原菌（）部分研究结果与前人报道存在差异，可能与菌株寄主来源和寄主地理环境有关。【本研究切入点】目前，贵州省内烤烟蛙眼病病原分类地位尚不明确，病原的生物学特性及其与其他省（区）病菌是否存在差异亦不清楚，缺乏系统性研究。【拟解决的关键问题】以采集自贵州烟区的烤烟蛙眼病病叶为材料，采用常规组织分离法和离体叶片接种法进行病原菌分离及致病性测定，利用形态学特征和分子生物学方法对病原菌进行种类鉴定，并对典型菌株进行生物学特性测定，以期为烤烟蛙眼病的综合防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2020年7—10 月，从贵州省铜仁市、安顺市西秀区、安顺市普定县、遵义市、遵义市凤岗县、福泉市、黔东南州施秉县、毕节市威宁县、毕节市大方县、黔西南州兴仁市、贵阳市开阳县和黔南州翁安县等12个市（县）采集具有烤烟蛙眼病典型症状的病叶用于病原菌分离。供试烤烟品种：K326。供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）、胡萝卜琼脂培养基（CA）、水琼脂培养基（WA）、查氏培养基（Czapek）、燕麦片琼脂培养基（OA）、玉米粉琼脂培养基（CMA）、麦芽提取琼脂培养基（MEA）、烟叶煎汁培养基（TA1：新鲜烟叶200 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL）和番茄琼脂培养基（TA2：番茄200 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL）。

1.2 病原菌的分离纯化及形态学鉴定

采用组织分离法对病害样本进行病原菌分离及纯化（方中达，2001）。将表面消毒后的小块病健交界组织置入PDA培养基，28 ℃培养7 d。用打孔器打取直径为6 mm的菌饼转接入PDA培养基，28 ℃培养7 d后，观察病原菌菌落形态、颜色、气生菌丝、分生孢子和分生孢子梗的形态特征。

1.3 病原菌致病性测定

选取盆栽管理的健康烤烟新鲜叶片，根据柯赫氏法则，采用离体叶片有伤接种法进行致病性测定（裴月令等，2011），选取致病力较强的菌株进行后续试验。

1.4 分子生物学鉴定

1.4.1 病原菌DNA提取 参照试剂盒（DNeasy UltraClean Microbial Kit，Qiagen）说明书提取病原菌DNA。

1.4.2 ITS序列扩增 采用引物ITS4（5'-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3'）/ITS5（5'-GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3'）（上海捷瑞生物工程有限公司合成）对病原菌ITS序列进行PCR扩增。20.0 μL反应体系：PCR Premix 10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，DNA模板2.0 μL，ddHO 7.2 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；95 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃1 min，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。

1.4.3 ITS序列分析 电泳检测合格的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，序列在NCBI上进行BLAST比对分析，同时将序列提交至GenBank获取登录号。下载相似性在99%以上的基因序列，利用MEGA X 的NJ（Neighbor-joining）法构建系统发育进化树。

1.5 病原菌生物学特性测定

1.5.1 不同培养基对病原菌生长及产孢量的影响采用10种供试培养基，在培养皿中央接种直径为6 mm的病原菌菌饼，28 ℃培养。

1.5.2 不同温度、pH和光照条件对病原菌生长及产孢的影响 分别设置5、10、15、20、25、28、30和35 ℃共8个梯度温度；用1 mol/L的NaOH溶液或1 mol/L的HCl溶液将PDA培养基pH依次调至5、6、7、8、9、10和11共7个梯度；光照条件设置24 h全光照、24 h全黑暗和12 h光暗交替共3个处理。

1.5.3 不同碳源、氮源对病原菌生长及产孢的影响 以Czapek培养基为基础培养基，分别以蔗糖及等量替换的葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、麦芽糖、果糖、山梨醇和甘露醇为碳源，分别以硝酸钠及等量替换的丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、尿素、蛋白胨、牛肉浸粉和氯化铵为氮源，配制不同碳源和氮源的培养基，以不加碳源和氮源的培养基为对照，分别将直径为6 mm的病原菌菌饼放置于培养皿中央，28 ℃培养。

1.5.4 病原菌致死温度测定 采用6 mm直径打孔器打取病原菌菌饼，置于预先装有1 mL无菌水的离心管中，分别于50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和60 ℃恒温水浴10 min，用无菌牙签挑取菌饼，置于PDA培养基培养7 d（邹凯茜等，2020）。每个温度试验设3个重复。

1.5.5 数据收集与分析 以上不同培养基、温度、pH、光照条件、碳源和氮源试验均设3个重复，分别于培养3、5和7 d后采用十字交叉法测量菌落直径；培养7 d后，每皿用10 mL无菌水洗涤平板并刮下所有病原菌菌丝体于50 mL离心管中，晃动悬浮液1 min，每皿每次取5 μL悬浮液，共取3次，在光学显微镜下镜检记录孢子数。利用SPSS 26.0对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 烤烟蛙眼病症状

烤烟蛙眼病田间症状主要表现为病斑圆形或近圆形，单个，严重时几个病斑连在一起（图1-A）。病斑边缘深褐色，中心为白色小点，类似“蛙眼”状，病斑周边有淡黄色的晕圈，后期病斑中心可发生破烂穿孔，空气潮湿时病斑上长有灰白色霉层（图1-B）。

图1 烤烟蛙眼病田间症状Fig.1 Symptoms of flue-cured tobacco frog eye disease in field

2.2 烤烟蛙眼病病原菌的分离与致病性测定结果

从采集的病叶样本中共分离获得11株菌株，选取具有代表性的分别来源于施秉县、凤冈县和开阳县的3株菌株YC1110、YC1111、YC1112接种到健康烤烟叶片上，接种6 d后出现典型症状（图2），与田间症状一致，对照叶片未见感病症状，表明3株菌株为烤烟蛙眼病病原菌。

图2 分离菌株对烤烟叶片的致病性测定Fig.2 Pathogenicity determination of isolated strains to fluecured tobacco leaves

2.3 烤烟蛙眼病病原菌形态学鉴定结果

供试病原菌在PDA培养基上培养7 d，菌落呈较规则圆形，正面粉白，背面米黄；气生菌丝较少，菌丝匍匐（图3-A和图3-B）。在TA2培养基上，菌落圆形，有同心轮纹，背面玫红色（图3-C和图3-D）；在PSA培养基上，菌落圆形，背面中心黑色，边缘粉红色，具同心轮纹（图3-E和图3-F）。分生孢子梗大小为47.59～227.54 μm×2.27～6.01 μm，个别有分支，呈膝状弯曲；分生孢子大小为28.11～388.78 μm×1.53～6.24 μm，无分支，呈针状，基部平切，顶端略尖，无色透明或淡褐色，有隔膜但不明显（图4）。

图3 病原菌在不同培养基上的形态Fig.3 Morphology of pathogens on different mediums

图4 病原菌分生孢子及分生孢子梗形态Fig.4 Conidia and conidiophore morphology of pathogen

2.4 烤烟蛙眼病病原菌分子鉴定结果

提 取 供 试 菌 株YC1110、YC1111 和YC1112 的DNA，以各菌株的DNA为模板，对ITS序列进行PCR扩增并测序。YC1110、YC1111和YC1112菌株扩增得到的ITS序列长度分别为535、540和547 bp，经BLAST比对分析，3株菌株与烟草尾孢（登录号AF297230）的同源性均达99.8%以上。从系统发育进化树（图5）可看出，3株菌株与烟草尾孢（登录号AF297230）聚为一支。通过病原菌的致病性测定、形态学特征结合ITS序列及系统发育进化树分析，将引起贵州烤烟蛙眼病的病原菌鉴定为烟草尾孢（），序列提交至GenBank后获取登录号分别为OK078873、OK078874和OK078875。

图5 基于YC1110、YC1111和YC1112菌株ITS序列构建的系统发育进化树Fig.5 Phylogenetic tree based on ITS sequences of YC1110，YC1111 and YC1112 strains

2.5 烤烟蛙眼病病原菌生物学特性测定结果

选取致病力较强的菌株YC1110进行烤烟蛙眼病病原菌生物学特性测定。

2.5.1 不同培养基对病原菌菌落生长及产孢的影响病原菌在不同培养基上菌落生长速度和产孢量存在明显差异（表1）。病原菌在供试10种培养基上均能生长，菌落直径随着培养时间延长逐渐增大，其中生长至第7 d的最适培养基为CA培养基和TA1培养基，其次为PSA培养基；病原菌在WA培养基上的菌落直径与OA和MEA培养基差异不显著（＞0.05），但其菌丝稀疏，生长很差。不同培养基上的病原菌产孢量不同，其中在TA2培养基上的产孢最多，与在其他培养基上的产孢量差异显著（＜0.05，下同），其次为TA1和PSA培养基，WA培养基上的产孢最少。

表1 不同培养基对病原菌菌落生长及产孢的影响Table 1 Effects of different media on growth and spore production of pathogen colony

2.5.2 不同温度、pH、光照条件对病原菌菌落生长及产孢的影响 病原菌在10～35 ℃内均可生长，5 ℃时不生长，10 ℃时生长极缓慢，最适生长和产孢温度均为25 ℃，温度高于28 ℃后菌落生长明显缓慢，温度低于20 ℃或高于30 ℃均不利于病原菌生长和产孢（表2）。

表2 不同温度对病原菌菌落生长及产孢的影响Table 2 Effects of different temperatures on growth and spore production of pathogen colony

病原菌适宜生长的pH范围较广，在pH 5～11内均可生长和产孢，pH 7时最适宜病原菌的生长和产孢，其次为pH 6，pH 11时产孢量最少，生长也最慢（表3）。

表3 不同pH对病原菌菌落生长及产孢的影响Table 3 Effects of different pH on growth and spore production of pathogen colony

不同光照条件影响病原菌菌落生长及产孢。24 h全黑暗条件利于病原菌产孢，产孢量显著高于其他2个处理，12 h光暗交替条件下病原菌菌落生长较差且产孢较少（表4）。

表4 不同光照条件对病原菌菌落生长及产孢的影响Table 4 Effects of different lighting conditions on growth and spore production of pathogen colony

2.5.3 不同碳源、氮源对病原菌菌落生长及产孢的影响 由表5可看出，病原菌在甘露醇为碳源的培养基上菌落生长最快，培养7 d后的菌落直径显著大于其他处理；其次是可溶性淀粉培养基、葡萄糖培养基、山梨醇培养基和蔗糖培养基，麦芽糖培养基上菌落生长最慢。病原菌在不同碳源的培养基上产孢量不同，其中在果糖培养基上的产孢最多，其次为山梨醇培养基；葡萄糖培养基最不利于病原菌产孢，从其产孢量显著少于无碳源培养基来看，葡萄糖培养基甚至会抑制病原菌产孢。

表5 不同碳源对病原菌菌落生长及产孢的影响Table 5 Effects of different carbon sources on growth and spore production of pathogen colony

由表6可看出，病原菌菌落在蛋白胨为氮源的培养基上生长最快，其次为硝酸钠培养基和牛肉浸粉培养基，病原菌在尿素培养基上不生长；在无氮源培养基上病原菌菌落直径较大，但菌丝极稀疏，几乎透明。病原菌在不同氮源培养基上的产孢量不同，其中在牛肉浸粉培养基上产孢最多，其次是蛋白胨培养基，在无氮源和赖氨酸培养基上产孢较少，在尿素培养基上不产孢。

表6 不同氮源对病原菌菌落生长及产孢的影响Table 6 Effects of different nitrogen sources on growth and spore production of pathogen colony

2.5.4 病原菌致死温度测定结果 从图6可见，50、51、52和53 ℃下水浴10 min处理的菌饼明显增大，54 ℃及大于54 ℃下水浴10 min处理的菌饼大小无变化，说明菌丝致死温度为54 ℃水浴10 min。

图6 病原菌致死温度测定Fig.6 Determination of lethal temperature of pathogens

3 讨论

尾孢类丝孢菌（Cercosporoid hyphomycetes）中最早报道的属是Fries建立的钉孢属（Fr.），之后Fresenius建立了尾孢菌属（Fresen.），在尾孢属类真菌种的鉴定中采用“同属的真菌在种的鉴定上以寄主科为范围”的分类标准（郭英兰，2020）。尾孢属真菌是一种重要的植物病原菌（谢学文等，2017），其侵染范围广，可侵染多种植物，如烟草（Shamarao and Hundekar，2010）、玉米（刘庆奎等，2013）、绿豆（张海涛等，2016）、梧桐（郭英兰，2018）、甜瓜（叶云峰等，2018）、藜麦（殷辉等，2019）、花生（Bakhshi and Zare，2020）和甘蔗（高小宁等，2021）等。本研究的3株代表性菌株YC1110、YC1111和YC1112通过形态学特征观察、ITS序列及系统发育进化树分析，将其鉴定为烟草尾孢。形态学观察显示，病原菌在PDA培养基上培养特征为菌落呈较规则圆形，正面粉白，反面米黄，气生菌丝较少，菌丝匍匐，与范静华和陈海如（1994）的报道相似。病原菌在TA2培养基上菌落背面玫红色，在PSA培养基上菌落背面粉红色；菌落兼圆形且具同心轮纹。本研究病原菌分生孢子梗稍大于朱贤朝等（2001）报道的烟草尾孢分生孢子梗35.0～80.0 μm×3.5～5.0 μm；分生孢子小于山东报道的256.0～806.0 μm×4.1～19.5 μm（Li et al.，2016）。表明不同地区病原菌分生孢子和分生孢子梗大小存在差异。

本研究烤烟蛙眼病病原菌生物学特性测定结果显示，TA2和TA1培养基最有利于病原菌产孢，与Alasoadura和Fajola（1970）报道烟草尾孢在烟叶煎汁琼脂培养基上可大量产孢的研究结果相似。Li等（2016）研究结果显示，烟草尾孢在PDA培养基上无孢子产生，而在燕麦琼脂培养基中加入烟叶煎汁于黑暗中进行诱孢培养可产孢，表明烟叶可诱导病原菌孢子的产生。TA2和TA1培养基上的产孢量约是PDA培养基上的2倍，CA培养基最有利于病原菌生长。温度为25 ℃时最适宜病原菌生长与产孢，与黄声仪等（1994）报道烟草尾孢病害发展最适温度为26～30 ℃的研究结论基本一致。烤烟蛙眼病病原菌在pH 5～11内均可生长和产孢，pH 7时病原菌生长最快且产孢最多，pH 11时产孢最少，与范静华和陈海如（1994）报道烟草尾孢最适pH为4～5，pH 10以后的碱性环境不能生长的研究结果存在差异。烤烟蛙眼病病原菌致死温度为54 ℃水浴10 min，与何可佳等（1996）报道烟草尾孢致死温度为55 ℃10 min的研究结果相近，而与范静华和陈海如（1994）报道烟草尾孢致死温度为63 ℃10 min的研究结果存在较大差异。24 h全黑暗处理有利于烤烟蛙眼病病原菌产孢，12 h光暗交替处理不利于病原菌的生长与产孢。病原菌菌丝生长最适碳源为甘露醇、最适氮源为蛋白胨；碳源为果糖、氮源为牛肉浸粉时病原菌产孢最多，与何可佳等（1996）报道烟草尾孢最适碳源为蔗糖，病原菌在具L-天冬酞胺的培养基上生长最好的研究结果存在差异。本研究中的尾孢菌分离自贵州烟区，上述差异的产生可能与生态环境有关，表明来自不同寄主尾孢菌或相同寄主不同地区尾孢菌在生物学特性上存在差异。

4 结论

贵州烤烟蛙眼病病原菌为烟草尾孢（）。烟草尾孢菌丝生长温度和pH范围较宽，在TA2和TA1培养基上产孢最多。研究结果为后续贵州烤烟蛙眼病发生规律、抗病鉴定、防治药剂筛选及综合防治等研究提供参考。