吕和鑫，贾士儒，柴 谦，刘景君，尚 波，刘翼飞

（1.天津科技大学 生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室 省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457；2.山东省食品药品审评查验中心，山东 济南 250013；3.山东纳美达生物科技有限公司，山东 济南 250132；4.澳门科技大学 药学院，澳门 999078）

随着新冠疫情的爆发以及人口老龄化伴随的慢性病的常发，使得人们对自身的免疫健康更加重视，近些年免疫调节食品的需求呈现巨幅提升趋势。市场研究机构Euromonitor International公司的调查数据表明，在全球范围内，免疫系统调节类的食品营养强化剂等的销售额在2020年为79 亿美元，而在2019 年为68 亿美元，一年之内增长率便达到14.9%[1]。纤细裸藻是一种单细胞藻类，为我国2013年新批准的新资源食品，也是美国、日本等国已批准的新食品原料（Novel food），其胞内含有的线性β-1,3-葡聚糖在美国也已被批准为食品原料[2]。目前，纤细裸藻发酵生产技术已比较成熟，已在包括我国在内的多个国家实现了工业化生产。

纤细裸藻（Euglena gracilis）在生物学上，是一种无细胞壁的单细胞微生物，细胞的一端带有两个鞭毛，能够游动，细胞由蛋白质外膜包被。因胞内含有由三层质膜包被的叶绿体，可进行光合作用，因此被归入淡水单细胞微藻类。但在分类学上，纤细裸藻被认为是一种通过内共生过程，获得了叶绿体的眼虫目单细胞原生动物，是一种比较原始的单细胞动物。有研究数据表明，纤细裸藻的蛋白氨基酸评分高达88分，蛋白净利用率高达79.9%，与牛奶酪蛋白接近[3]。除优质蛋白外，纤细裸藻还含有多种于人类健康有特殊意义的营养成分，如β-1,3-葡聚糖三螺旋晶体、维生素E中活性最强的同分异构体α-生育酚、多不饱和脂肪酸如二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、多种矿物质等。本文首先调研了纤细裸藻异养发酵培养工艺及代谢机制方面的研究进展，然后归纳了近些年纤细裸藻β-1,3-葡聚糖生理功能研究方面的研究进展，以期给国内裸藻异养发酵的应用研究与基质代谢方面的基础研究提供理论支持，进一步通过介绍裸藻β-1,3-葡聚糖在促免疫、抗病毒等方面的研究成果，以期为纤细裸藻β-1,3-葡聚糖在食品、药物、化妆品、新材料等领域的开发应用提供支持。

1 纤细裸藻发异养发酵研究进展

当前，纤细裸藻的大规模培养主要采用三种模式，前两类是光合自养培养模式，一种为开放式跑道池培养，另一种为封闭式光生物反应器（如玻璃管道）培养。第三种为基于现代发酵工程理论，发酵过程严格控制的异养发酵培养。两类培养方式在生产能力、细胞色素组成与葡聚糖含量等方面差异巨大。异养发酵的裸藻粉呈颜色鲜艳的黄色至淡黄色，生长周期短至3 d左右，培养末期β-1,3-葡聚糖的含量在60%～75%之间，而光合自养的裸藻粉为绿色，生长周期较长，葡聚糖含量较低，对数期纤细裸藻细胞的葡聚糖约在1.7%～7.0%之间，9 d时到达培养末期，葡聚糖含量升高至50%左右[4]。纤细裸藻异养发酵具有培养因子可精确控制、培养周期短、葡聚糖含量高等优点，使得纤细裸藻异养发酵更容易工厂化生产，也因此得到了较多的研究，本部分从条件因子优化与代谢机制两个方面介绍纤细裸藻异养发酵的研究进展情况。

图1 异养纤细裸藻与光合自养纤细裸藻的对比Fig. 1 Comparation of heterotrophic and photosynthetic Euglena gracilis

1.1 异养发酵条件因子优化的研究进展

除采用常见的发酵基质外，有研究也采用工业废料或污水等培养纤细裸藻，如早在1976年，便有研究使用奶酪生产的废液乳清培养纤细裸藻[16]。SĂNTEK B等[17]研究了土豆汁（potato liquor）分批发酵裸藻，培养16 d，产量可达到20 g/L。最近有研究使用活性污泥处理后的废水以及糖蜜等有机废液作为培养基质，采用混合营养的方式（异养与光合自养同时进行）培养纤细裸藻[18]。也有研究采用混菌发酵的方式进行纤细裸藻发酵，如JEON M S等[19]通过共培养假交替单胞菌（Pseudoalteromonassp.）MEBiC 03607与纤细裸藻，提高了纤细裸藻的生物量与裸藻β-1,3-葡聚糖的含量，分子水平数据表明假交替单胞菌提高了裸藻β-1,3-葡聚糖合成相关基因的表达水平，而抑制了蜡酯合成相关基因的表达。类似地，共培养假交替单胞菌（Pseudoalteromonassp.）MEBiC 03485与纤细裸藻也表现了对纤细裸藻的生长促进作用[20]。共培养吲哚-3-乙酸生产菌需钠弧菌（Vibrionatriegens）与纤细裸藻也有类似的生长促进与裸藻β-1,3-葡聚糖合成作用[21]。

1.2 异养发酵中代谢机理的研究进展

已经鉴定的藻类中，大约22%的藻类需要外源维生素B1，大约55%的藻类需要外源维生素B12才能维持正常生长。纤细裸藻的正常生长需要外源维生素B1与B12的存在。纤细裸藻通过主动运输系统吸收与积累大量的外源维生素B1与B12。除维生素B1与B12之外，纤细裸藻可合成维持正常生长所需要的其他维生素种类。相比其他微藻，纤细裸藻胞内含有较高水平的维生素C与维生素E。维生素B12主要与纤细裸藻的甲基代谢有关，参与核糖核酸脱氧生成脱氧核糖核酸的过程[22-23]。培养基中维生素B12的耗尽会导致细胞变大与停止分裂。培养基中维生素B12的缺乏对纤细裸藻生长的抑制作用与碳源种类以及光周期有关。培养基中缺乏维生素B12，对连续光照培养的纤细裸的生长抑制最明显，6 h光照/6 h黑暗光周期下的纤细裸藻的抑制稍弱，而黑暗培养的纤细裸藻则无显著的抑制作用。因此光照加剧了维生素B12对纤细裸藻细胞的生长抑制作用。这种光周期相关的生长抑制现象与碳源种类有关，使用苹果酸与谷氨酸作为碳氮源的培养基，只要发生维生素B12缺乏，纤细裸藻细胞便会停止生长，而乳酸作为碳源时，在黑暗条件下维生素B12缺乏不会抑制纤细裸藻生长。在提高溶氧或者降低CO2浓度的培养条件下，如黑暗条件下增加振荡或红光或白光下，维生素B12的缺乏会抑制纤细裸藻的生长，这种抑制作用在将细胞转移至黑暗静止培养基，或加入光合电子传递链敌草隆的光照条件下时可被逆转[24]。纤细裸藻发酵液中存在一种维生素B12的结合因子，结合后的维生素B12不可透过透析膜，不可被大肠杆菌细胞吸收，这种结合因子含量随着培养时间的延长而增加[25]。维生素B12的摄入有两个阶段，一个是结合位点未饱和的阶段，此阶段维生素B12的吸收较快，吸收部位主要集中于叶绿体，第二个是新的结合位点形成的阶段[26]。维生素B12的缺乏会导致对数期裸藻呼吸速率的增加达2倍以上[27]。纤细裸藻在2 h内便可利用主动运输途径，将培养基中的大部分维生素B1摄入细胞，胞内的维生素B1达96%以上以自由形式存在，胞内维生素B1的水平会影响纤细裸藻细胞分裂周期的长短[28]。

眼虫科中，目前仅发现纤细裸藻可直接摄取外源葡萄糖，一些小分子代谢物，如三羧酸循环中的琥珀酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、苹果酸、草酰乙酸以及甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、二氧化碳等，可促进葡萄糖的吸收利用，明显缩短延滞期时间与增加生物质产量，微量的这些小分子代谢物便可显著促进纤细裸藻的生长。这种生长促进作用的潜在机制尚不清楚，推测机理为这些小分子可进入三羧酸循环，增加内源草酰乙酸的含量而促进末端呼吸链的反应效率。在pH 3.0～5.0之间时，纤细裸藻对葡萄糖的利用最高效，培养液中加入甘氨酸可以进一步扩大这个pH范围。在有柠檬酸存在的情况下，纤细裸藻可以在pH 7.0下利用葡萄糖进行生长，因数据表明柠檬酸不能被纤细裸藻吸收利用，并且乙二胺四乙酸可替代柠檬酸的以上作用，因此柠檬酸被认为在pH 7.0时促进葡萄糖的利用仅是起到了螯合剂的作用。糖酵解（embden-meyerhof-pathway，EMP）途径与磷酸戊糖途径的多种酶存在于发酵上清液中，虽然这些酶均是从酸性发酵液中分离得到，但这些酶的最适pH值为7.5～8.6[29]。葡萄糖作为碳源要优于乙酸，乙酸作为碳源时纤细裸藻细胞的呼吸速率比葡萄糖作为碳源时高，并且含有较高的核糖核酸含量[30]。在蛋白胨为氮源培养纤细裸藻时，葡萄糖的最适浓度为1%，低浓度的蛋白胨或琥珀酸便可促进葡萄糖的同化吸收。CO2同样具有促进葡萄糖同化的作用，大约90%以上被摄入细胞的葡萄糖被同化，大约10%的葡萄糖经呼吸作用以CO2方式释放。葡萄糖的加入并没有提高呼吸作用[31]。乙醇与醋酸可被纤细裸藻作为有机碳源直接利用，两者会抑制叶绿素的合成而使纤细裸藻细胞进入异养生长。乙醇抑制葡萄糖的酵解利用但不影响其作为底物合成裸藻β-1,3-葡聚糖。丙酮酸可经糖异生途径转化成葡萄糖，丙酮酸的甲基与羧基碳多数进入裸藻β-1,3-葡聚糖。乙醇被氧化成乙酸，多达50%的甲基碳进入裸藻β-1,3-葡聚糖。乙醇抑制葡萄糖与丙酮酸进入酵解与呼吸代谢，同时也抑制葡萄糖与丙酮酸向脂类与蛋白质的转化，而促使葡萄糖进入裸藻β-1,3-葡聚糖合成途径[32]。

2 纤细裸藻β-1,3-葡聚糖及其功效研究进展

2.1 裸藻β-1，3-葡聚糖的纯化、结构分析研究进展

裸藻纲微藻细胞质内均含有一种本纲微藻特有的β-1,3-葡聚糖颗粒，19世纪时科学家发现此类颗粒外形类似淀粉，但遇碘不显蓝色，因此命名为Paramylon，有的学者将其翻译为副淀粉。聚焦离子束与扫描电镜研究表明，裸藻β-1,3-葡聚糖为一种由三螺旋β-1,3-葡聚糖链组成的晶体，外形为饼状，直径约5μm，厚度约3μm，晶体表面致密，未见孔道结构，表面积与淀粉粒类似[33]（见图2）。CLARKE A E等[34]首次报道了裸藻β-1,3-葡聚糖的提取方法，首先离心收集细胞，后水洗两次，后再用乙醇与氯仿去除色素，然后在加有1%胰蛋白酶的0.1 mol/L pH 7.6的磷酸缓冲液中40 ℃处理12 h，沉淀使用90%的尿素与水进行抽提漂洗，获得的灰白色沉淀继续使用SEVAG'S方法去除蛋白，离心收集得到的白色沉淀即为裸藻β-1,3-葡聚糖颗粒，这些葡聚糖颗粒具有折光性，电镜观察表明，其表面由一层纵向排列的纤维膜包被，利用ARNOLD'S胼胝质染色剂处理后无黄色荧光。裸藻β-1,3-葡聚糖颗粒可溶于5%的NaOH、55%硫酸、甲醛、无水甲酸等，在低浓度的以上试剂中，裸藻β-1,3-葡聚糖颗粒出现膨胀。KOBAYASHI K等[35]的研究表明，裸藻β-1,3-葡聚糖颗粒在生理状态与脱水状态下存在晶体转换现象，在相对湿度＜30%时，裸藻β-1,3-葡聚糖颗粒发生脱水晶体转换，而在相对湿度高于70%时重新水化，但晶体大小与分子结构的均一性均无法恢复到脱水前的状态。现在研究中一般采用超声波破碎细胞，离心去除上清，然后使用十二烷基硫酸钠脱去脂类与蛋白质，最后用清水洗涤的方法提取与纯化裸藻β-1,3-葡聚糖。裸藻β-1,3-葡聚糖的定量测定一般采用提取后称干质量的方法。β-葡聚糖结合刚果红后会发出荧光，鞠海军[36]报道了一种基于刚果红染色的裸藻β-1,3-葡聚糖的定量方法，使得原位测定微量裸藻β-1,3-葡聚糖成为可能，使用淀粉、纤维素等作为阴性对照，表明此种定量方法具有较好的专一性与准确度。

图2 裸藻β-1,3-葡聚糖场发射扫描显微镜照片Fig. 2 Field emission scanning microscope image of Euglena gracilis β-1,3-glucan

2.2 裸藻β-1,3-葡聚糖生理功效研究进展

归纳已报道的裸藻与裸藻β-1,3-葡聚糖生理功效相关的研究数据见表1。

表1 裸藻与裸藻β-1,3-葡聚糖生理功效Table 1 Physiological functions of Euglena gracilis and Euglena gracilis β-1,3-glucan

2.2.1 抗癌

研究表明，裸藻β-1,3-葡聚糖可降低患癌的风险，抑制肿瘤细胞的发展。如饲喂裸藻β-1,3-葡聚糖（2%，饲料中含有2%质量分数的裸藻β-1,3-葡聚糖）可使小鼠结肠癌发展降低50%[37]。通过给小鼠喂食从裸藻中分离得到的裸藻β-1,3-葡聚糖粉末，研究其对小鼠结肠中肿瘤前异常隐窝灶（aberrant crypt foci，ACF）的作用效果，发现裸藻β-1,3-葡聚糖可明显抑制ACF的发展，表明裸藻β-1,3-葡聚糖具有预防与抑制结肠癌的效果。另有研究采用先给小鼠移植腹水瘤S-180，然后在24 h后给小鼠腹腔注射1 μg/g裸藻β-1,3-葡聚糖溶液，结果表明，裸藻β-1,3-葡聚糖对腹水瘤的抑制作用非常显著[38]。另有研究表明，裸藻β-1,3-葡聚糖可以通过线粒体途径诱导HepG2肝癌细胞凋亡[36]。

所有患者采用随机数字表法分为舌下含服组和口服组,每组各40例。口服组患者口服酒石酸美托洛尔片(阿斯利康制药有限公司,产品批号1407184)25 mg(1片);舌下含服组患者舌下含服酒石酸美托洛尔片25 mg(1片)。

2021年最新报道，口服50 mg的裸藻粉与裸藻β-1,3-葡聚糖3周，可显著降低A4gnt基因敲除胃癌小鼠幽门粘膜中CD3阳性T-淋巴细胞的数量，并显著降低多形核白细胞浸润现象，下调了Il11与Cxcl1基因的表达以及小肠中IgA抗体的浓度。口服裸藻β-1,3-葡聚糖可显著降低A4gnt基因敲除小鼠阳性的幽门粘膜中CD3阳性淋巴细胞的数量，下调Il11与Ccl2基因的表达，说明口服裸藻粉或裸藻β-1,3-葡聚糖均可以改善胃癌早期胃粘膜炎症反应[39]。

2.2.2 抗病毒

饲喂小鼠裸藻β-1,3-葡聚糖（2%）可显著提高流感病毒抵抗力，体内细胞因子的水平如γ-干扰素（γ-interferon，IFN-γ）等显著升高[40]。

2.2.3 护肝

有研究评估了裸藻β-1,3-葡聚糖对CCl4诱发的小鼠急性肝损伤的治疗效果。在腹膜单次内使用50%CCl4（2 mg/kg）处理小鼠之前，给小鼠喂食裸藻β-1,3-葡聚糖（500 mg/kg、1 000 mg/kg、2 000 mg/kg，β-1,3-葡聚糖量/小鼠体质量，以下同），24 h后处死小鼠，收集血样，测定血清的生化参数；将肝切除评估超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力，对肝进行组织病理学诊断。结果表明，喂食裸藻β-1,3-葡聚糖可显著抑制血清肝酶标志物的产生，能够抑制CCl4诱导的脂肪变性和肝坏死，抑制了肝细胞的凋亡。裸藻β-1,3-葡聚糖通过抗氧化机制对CCl4诱导产生的急性肝损伤，产生保护效果[41]。裸藻β-1,3-葡聚糖链断裂后形成的纳米纤维对CCl4诱发的小鼠急性肝损伤的治疗效果更好[42]。

2.2.4 促免疫

裸藻β-1,3-葡聚糖用作疫苗佐剂可显著提高小鼠羊红血细胞的抗体反应，裸藻β-1,3-葡聚糖的给药剂量是10 mg/kg时，抗羊红血细胞血小板的产生数量显著增加[43]。提取喂食过裸藻β-1，3-葡聚糖的小鼠的巨噬细胞，在体外使用脂多糖处理巨噬细胞后，能产生大量的白细胞间介素-1（interleukin-1，IL-1）。在进行该实验时也发现小鼠体内血浆之中IL-6会产生一个瞬态的变化。IL-1和IL-6在免疫系统中扮演着重要的角色，因此，裸藻β-1,3-葡聚糖通过提高小鼠产生这些小分子蛋白，来增强小鼠机体的免疫力[43]。

使用随机双盲实验，研究上裸藻β-1,3-葡聚糖对上呼吸道感染（upper respiratory tract inflection，UTR1）症状的影响，以及裸藻粉（含β-1,3-葡聚糖50%以上）对免疫系统的影响。34名进行耐力训练的健康参与者被随机分成两组，分别服用367 mg裸藻粉或安慰剂各90 d。对临床化学、血液学、生命体征等24项上呼吸道症状改善情况进行分析和安全性评估。结果表明，与安慰剂组相比，喂食裸藻粉组30 d以上的参与者的症状和整体严重程度显著减少。所有安全性指标均在临床正常范围内。该研究提供的证据表明，补充含有50%以上β-1,3-葡聚糖的裸藻粉可减少和预防荨麻疹症状，显著提高免疫力，保护机体健康[44]。

另有研究表明，裸藻β-1,3-葡聚糖是通过增加NO，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor α，TNF-α），IL-6与环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）等前炎症分子的表达来激活淋巴单核细胞，淋巴细胞的激活不需要裸藻β-1,3-葡聚糖内吞到胞内即可发挥免疫激活作用。碱处理后超声粉碎后的裸藻β-1,3-葡聚糖的活性更强[45]。

2.2.5 消除机体炎症

使用2,4,6-三硝基氯苯反复处理小鼠可引起过敏性皮肤炎，口服裸藻β-1,3-葡聚糖可明显缓解过敏性皮炎症状。通过观察皮肤病变以及耳溶胀情况，并根据血清中的抗体总浓度、细胞因子IL-4、IL-12、IL-18以及INF-γ的水平来评估裸藻β-1,3-葡聚糖的药效作用，结果表明，裸藻β-1,3-葡聚糖通过阻断T辅助细胞Th1以及Th2途径，达到治疗小鼠的过敏性皮肤损伤的效果。裸藻β-1,3-葡聚糖可以为过敏性皮肤炎的治疗提供有效的替代疗法[46]。使用胶原诱导的关节炎小鼠模型，证明口服裸藻粉和裸藻β-1,3-葡聚糖对类风湿性关节炎症状的缓解有显著效果。通过临床关节炎症状以及淋巴组织中的细胞因子IL-17，IL-6和INF-γ的水平用来评价裸藻粉和裸藻β-1,3-葡聚糖的作用效果。结果显示，与对照组相比，裸藻粉和裸藻β-1,3-葡聚糖均降低了关节炎症状视觉评估评分的过渡性变化，结果表明，裸藻β-1,3-葡聚糖可显著缓解类风湿性关节炎症状[47]。除提高免疫响应外，饲喂小鼠裸藻β-1,3-葡聚糖后可降低过敏性皮炎、关节炎与非酒精性脂肪肝炎症状[46-48]。此外，有研究报道将裸藻β-1,3-葡聚糖加入到创可贴中可显著加快伤口愈合[49]。

2.2.6 抗菌

饲喂裸藻β-1,3-葡聚糖（1%）可显著提高大肠杆菌感染后的小鼠的存活率，小鼠免疫响应（抗体、IL-2、自然杀伤细胞等）显著提高，该研究还使用了酵母β-葡聚糖作为对照，研究结果表明裸藻β-1,3-葡聚糖在小鼠免疫响应效果上明显优于酵母来源的β-1,3-葡聚糖[50]。

2.2.7 提高精子活力

有研究报道，表明口服裸藻β-1,3-葡聚糖可显著提高大鼠精子运动能力、精子存活度与顶体完整度等[51]。

2.2.8 缓解痛风肿胀

将裸藻β-1,3-葡聚糖和裸藻粉分别按照1%添加量（2%）制成颗粒饲料，进行小鼠饲喂实验，每组5只小鼠，观察其对小鼠痛风性关节炎的作用，研究结果表明裸藻β-1,3-葡聚糖和裸藻粉并不能提高小鼠痛阈，但添加1%裸藻粉能对小鼠足掌肿胀有明显缓解作用。苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）结果表明添加1%裸藻β-1,3-葡聚糖及1%裸藻粉均减轻了小鼠足底炎症[36]。

2.2.9 降胆固醇

有研究表明，裸藻β-1,3-葡聚糖作为膳食纤维添加剂，可以促进大鼠胆固醇随大便排出体外，从而降低组织中胆固醇水平[52]。

2.2.10 肾保护作用

饲喂裸藻β-1,3-葡聚糖（5%）8周，明显减轻了肾小球硬化与小管间质与足状突细胞损伤，肾纤维化与肾小管间质炎症细胞浸润明显缓解，促炎症细胞因子基因的表达被抑制，尿毒症毒素的积累减少[53]。

3 展望

纤细裸藻异养发酵生产虽然已经取得了成功，但相关的生理与分子调控机制依然了解极少。比如维生素代谢在基因表达水平上的调控机制，裸藻β-1,3-葡聚糖合成与降解的酶学与基因调控分子机制，异养发酵过程中纤细裸藻对碳氮源的代谢机制，纤细裸藻对培养基质渗透压等外部环境因子的耐受机制等等，均需要在未来的研究中阐明。裸藻β-1,3-葡聚糖生理功效的研究虽然已较多，但依然需要更深入在分子水平上阐释其免疫调控的机制。

从产业发展角度上看，虽然纤细裸藻在我国获批了已有8年，但目前该类产品的生产规模依然较小，我国近年已有企业在生产，产能规模依然亟需扩大，产品种类也亟需多样化。目前国内也还没有统一的纤细裸藻食品国家标准，目前各企业主要参照藻类及其制品国家标准制定企业标准，导致了光合自养培养与异养发酵纤细裸藻在蛋白含量、裸藻β-1,3-葡聚糖含量等方面差异巨大，产品外观与产品质量也差异较大。目前裸藻β-1,3-葡聚糖尚未单独列入新食品原料目录，鉴于裸藻β-1,3-葡聚糖在免疫促进等方面的巨大潜力，推进裸藻β-1,3-葡聚糖的新食品原料收录，推进裸藻β-1,3-葡聚糖在新型冠状病毒功效方面的应用研究也是一项极为有意义的工作。