梁程博， 王久利， 孙 国， 冯 收， 卓平桂， 刘道鑫， 闫京艳*

(1.青海大学农牧学院， 青海 西宁 810016； 2.青海民族大学生态环境与资源学院， 青海 西宁 810007；3.青海大学昆仑学院， 青海 西宁 810016)

熊蜂(Bombusspp.)隶属于节肢动物门(Arthropoda)昆虫纲(Insecta)膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂科(Apidae)熊蜂属(Bombus)，是一类社会性传粉昆虫[1]。其在维护生态系统平衡中发挥重要作用[2]，是众多野生植物，尤其是高山植物和高原植物的重要传粉者[3-6]。中国对熊蜂区系的研究起步较晚，20世纪70年代前，有关中国的熊蜂区系研究主要由西方学者进行；20世纪70年代后，中国科学院动物研究所等单位开展了一系列科考活动并报道了中国部分地区的熊蜂物种名录；近20年来，中国农业科学院蜜蜂研究所牵头开展了中国熊蜂资源本底调查。黄家兴等[7]对中国熊蜂多样性进行了研究，报道了125种熊蜂，占全球熊蜂资源的50%，认为中国是熊蜂物种资源最丰富的国家；但目前，中国西部的部分地区仍缺少熊蜂多样性研究(图1)，其中包括重要的生态功能区——三江源地区。

图1 中国熊蜂调查样点分布Fig.1 Distribution sites of the bumblebees of China注：基于中国农业科学院蜜蜂研究所2002—2017年采集的标本[7]Note:Based on the records of the collection of Institute of Apicultural Research of China Academy of Agricultural Science between 2002—2017

三江源地区是长江、黄河和澜沧江重要的水资源供给地[8-10]，是世界高寒生物资源库[11]，也是我国江河中下游地区和东南亚国家生态环境安全和区域可持续发展的生态屏障[12]。因其恶劣的生态环境，当地传粉昆虫种类少，尤其在高寒草地生态系统中，许多植物都严重依赖熊蜂授粉[2]。了解熊蜂分布情况是对其进行保护和利用，进而保护生态环境的基础。

本研究对三江源地区熊蜂组成情况进行了调查与分析，为系统地认识该地区熊蜂组成情况和更完善地了解中国熊蜂资源提供了资料，为三江源地区传粉昆虫资源保护和生态平衡维持提供了基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2019年至2021年每年的7月至8月，在三江源地区(北纬31°32′至36°16′，东经89°23′至99°20′内)的玛多县、玉树市、治多县、囊谦县、称多县、杂多县和曲麻莱县7个行政区进行样品采集。行政区划分及本文所绘地图均基于国家基础地理信息中心(http://www.ngcc.cn/ngcc/)审图号为GS(2016)2556的标准公益性地图。在每个采样点的采集范围约1 km2，采集时间约1 h。采集时，用捕虫网采集熊蜂后，将其放入矿泉水瓶中，待其死亡。将死亡的熊蜂进行统一编号后，针插并放入标本盒保存。共在84个样点采集到1 467头熊蜂(样点分布见图2)。

图2 采样点分布Fig.2 The sampling points distribution

1.2 样品鉴定

首先，通过毛色、上颚和后足胫节等形态学鉴别特征对样品进行形态学鉴定[1,13-15]，依据鉴定结果将全部样品分亚属、种归类存放。而后每种选取1～3头进行分子生物学鉴定。分子生物学鉴定基于16S rDNA和COI基因的序列分析。首先，视样品体型取右后足或右侧后足与中足，碾碎，用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒(上海生物工程有限公司)提取DNA。而后，对其线粒体16S rDNA(引物：F-5′-CACCTGTTTATCAAAAAC-AT-3′； R-5′-TATAGATAGAAACCAATCTG-3′)和COⅠ(引物：F-5′-GGTCAACAAATCATAAAGATA-TTGG-3′；R-5′-TAAACTTCAGGGTG-ACCAAAAAATCA-3′)基因进行PCR扩增。反应体系均为40 μL，其中DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL，10×Buffer (Mg2+) 5 μL，dNTPs混合物2.5 μL，Tap酶0.5 μL，ddH2O 29 μL。两序列的扩增条件除退火过程不同外(16S rDNA：59℃，40 s；COⅠ：47.9℃，40 s)，其他均相同，为95℃预变性4 min，95℃变性40 s，72℃延伸45 s，72℃总延伸6 min；循环均为45次。利用琼脂糖凝胶电泳对扩增效果进行检测，确定扩增出目标条带且无杂带后将扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行Sanger测序。结合峰图用MEGA v7进行校对，将校对后的序列在GenBank中进行在线BLAST。结合形态学鉴定和BLAST结果进行最终鉴定。

1.3 物种多样性特征分析

根据鉴定结果，统计各样点和行政区的熊蜂物种组成情况。利用相对多度(Ra)、Berger-Parker优势度指数(D)、Margalef物种丰富度指数(Rs)、物种丰富度(S)、Shannon-Wiener多样性指数(H′)和Pielou均匀度指数(E)分析三江源地区及其中各行政区的熊蜂物种多样性特征。利用物种相似性系数和相同物种数比较各行政区间熊蜂组成的差异情况。根据梁铖[16]的标准，对三江源地区熊蜂优势种进行判定，判定标准为Ra≥ 10%者为优势种，5% ≤Ra< 10%者为丰盛种，1% ≤Ra< 5% 者为常见种，0.1% ≤Ra< 1%者为偶见种，Ra< 0.1%者为稀有种。上述多样性指数计算公式如下所示。

1)相对多度Ra

Ra=Na/N×100%

式中Na为物种a的个体数；N为所有物种的个体数。

2)Berger-Parker优势度指数(D)

D=Nmax/N

式中Nmax为优势种的个体数；N为全部种类的个体数。

3)Margalef物种丰富度指数(Rs)

Rs=(S-1)/lnN

式中S为物种数；N为全部物种的个体总数。

4)Shannon-Wiener指数(H′)

式中S为物种数；Pi为第i种个体占总个体数的比例。

5)Pielou物种均匀度(E)

式中S为物种数；Pi为第i种个体占总个体数的比例。

6)物种相似性系数(Cs)

式中c表示两个生境中共有物种数；a，b表示两个生境中分别所具有的物种数。

2 结果与分析

2.1 鉴定结果

本研究共鉴定21种熊蜂，涉及9个亚属(表1)。布氏熊蜂的16S和COⅠ等DNA条码数据暂未公布；本研究中的布氏熊蜂得到了形态学鉴定支持，其雌性标本的后足胫节不形成花粉框，生殖基节具“V”字型侧龙骨突，属拟熊蜂亚属；加上其它形态特征[14]，可以确定样品为布氏熊蜂。同时其16S rDNA的测序结果和同属于拟熊蜂亚属Psithyrus的崖熊蜂B.rupestris(NCBI登录号DQ788099)的比对相似度最高，为96.42%，初步验证了形态鉴定结果。另有一个种的形态鉴定结果与已记录熊蜂的形态特征均不同，且与GenBank中已知熊蜂参考序列的比对一致性均低于96%，本研究暂定为未知种(B.sp.SJY-2019)。根据形态特征，B.sp.SJY-2019被鉴定为属于拟熊蜂亚属；同时，其16S rDNA和COI分子标记的测序结果分别和属于拟熊蜂亚属Psithyrus的角熊蜂B.cornutus(NCBI登录号EF032353) 和图氏熊蜂B.turneri(NCBI登录号KX791753) 相似度最高，分别为95.19%和95.71%，即形态学和分子鉴定结果均支持B.sp. SJY-2019属于拟熊蜂亚属。因本研究只获得了少量B.sp. SJY-2019的蜂王标本，所以未能对该种进行明确的形态学描述。本研究中川熊蜂的鉴定得到了COI分子标记的支持，形态特征与已记录的川熊蜂特征仅存在少许差异；本研究中，标本4，5腹节背面毛色均为橙色，而已有的记录为白色(图3)；鉴于COI分子比对中较高的序列相似度(与NCBI中KP671623序列相似度为99.36%)且其他形态特征符合，本研究将其鉴定为川熊蜂。其他熊蜂的16S rDNA鉴定、COI基因鉴定和形态学鉴定的结果均一致，即分子鉴定结果与形态学鉴定结果相互支持。

表1 三江源地区熊蜂分布情况Table 1 Bumblebees composition in Sanjiangyuan region

续表1

图3 川熊蜂俯视图Fig.3 Planform of B. sichuansis注：(a)为本研究标本照片；(b)为已记录的示意图[1]Note:(a),the photographs of specimens in this study;(b),the recorded schematics diagram

2.2 物种多样性特征

根据形态和分子物种鉴定结果，各采样点和行政县/市的熊蜂物种组成如表1和图4所示，代表性采集点见表2。在分布范围方面，克什米尔熊蜂、越熊蜂、川熊蜂、拉达克熊蜂、红束熊蜂和稳纹熊蜂在7个行政区均有分布，其中，克什米尔熊蜂和稳纹熊蜂均为三江源地区的优势种(相对多度Ra≥ 10%)，越熊蜂、川熊蜂、拉达克熊蜂和红束熊蜂均为丰盛种(5% ≤Ra< 10%)。伪猛熊蜂也是丰盛种，但在囊谦未见其分布。苏氏熊蜂、布氏熊蜂、黑尾熊蜂、B.tibeticus和盗熊蜂为常见种(1% ≤Ra< 5%)，分别在3～6个行政区有分布。密林熊蜂、弗里熊蜂、斯科熊蜂、B. sp. SJY-2019、西伯熊蜂、猛熊蜂和兴熊蜂为偶见种(0.1% ≤Ra< 1%)，分别分布于1～4个行政区。凸污熊蜂和亚洲熊蜂均为稀有种(Ra< 0.1%)，均只有1个样品被采集。一些种在三江源地区具较小的相对多度，但却分布在较大的地理范围内分布，如黑尾熊蜂的相对多度为1.5%，多于斯科熊蜂(Ra=0.34%)，但前者仅在治多县、称多县和玉树市3个行政区被发现，而后者在曲麻莱县、玉树市、杂多县和位于三江源地区最南部的囊谦县4个行政区均有分布。

图4 各采样点的熊蜂物种组成Fig.4 Bumblebees composition at each locality注：图中各位点柱形长度与该位点采集熊蜂数成正比Note:The column length of each locality in the figure is proportional to the number of bumblebees collected at the locality

表2 代表性采集点Table 2 The representative collection localities

在7个行政区中，称多县的物种多样性最高，其物种数、多样性指数、丰富度指数和均匀度指数均高于其他行政区(表3)。曲麻莱县的物种多样性最低，物种数、个体数、多样性指数和均匀度指数均低于其他行政区。在治多县记录到的个体数最多，但其丰富度指数和均匀度指数最低，而优势度指数最高；这是因为该地区克什米尔熊蜂和稳纹熊蜂的数量多，其他物种数量少。克什米尔熊蜂和稳纹熊蜂是三江源地区的优势种(相对多度Ra≥ 10%)，二者约四分之一的个体在治多县被采集。

表3 各行政区熊蜂物种多样性特征Table 3 Species diversity characteristic of bumblebees in each administrative region

物种相似度分析结果表明(表4)，杂多县和玉树市物种相似度系数最高(0.857 1)，两地区有12个共有种；治多县与囊谦县的物种相似度最低(0.368 4)，两地区仅7个共有种。在三江源地区内，地理距离较小的地区间可能具有较大的物种相似性，如称多县和曲麻莱县相邻，二者的物种相似性系数为0.388 9，共有种7个；而称多县和杂多县被其他行政区相隔，二者的物种相似性系数为0.555 6，共有种10个。

表4 各行政区间相同物种数和相似性系数Table 4 Number of the shared species and the similarity coefficient among administrative regions

3 讨论

3.1 三江源地区熊蜂组成

本研究在三江源地区共发现隶属于9个亚属的20种已知种和1种未知种，其中布氏熊蜂、斯科熊蜂和B. sp. SJY-2019为寄生性熊蜂，其它18种为社会性熊蜂。20种已知种中，有越熊蜂、凸污熊蜂、川熊蜂和B.tibeticus4种中国特有种[7]，有稳纹熊蜂、凸污熊蜂、伪猛熊蜂、越熊蜂、兴熊蜂、克什米尔熊蜂、拉达克熊蜂、红束熊蜂、斯科熊蜂和B.tibeticus10种青藏高原特有种[14-15]。

根据Williams等[14-15,17-19]、王保海等[20]、安建东等[13]和黄家兴[1]的研究，青藏高原已记录隶属于11个亚属的87种熊蜂，其中社会性熊蜂和寄生性熊蜂分别有79种和9种。三江源地区熊蜂物种数、社会性熊蜂物种数和寄生性熊蜂物种数均超过整个青藏高原的20%。本研究记录的熊蜂，除未知种B.sp. SJY-2019外，其他种均已在青海有所记录。与王保海等[20]的研究相比，本研究在杂多县、囊谦县、称多县和玛多县，新记录到布氏熊蜂、盗熊蜂、弗里熊蜂、兴熊蜂、克什米尔熊蜂、西伯熊蜂、斯科熊蜂、黑尾熊蜂、苏氏熊蜂、B.tibeticus和川熊蜂。

利用传统形态学方法鉴定雌性熊蜂时，需通过毛色特征对同亚属的不同种进行区分。但此方法有时并不准确[1]。部分熊蜂存在体色多态性[21]，如本研究采集到的川熊蜂标本均与已记录的川熊蜂存在毛色上的差异。同时，不同种熊蜂的毛色可能存在趋同，如B.sp. SJY-2019在毛色上与西藏熊蜂几乎相同，这对熊蜂形态学鉴定和新种的发现造成了困难。进年来，几何形态学在昆虫分类上的应用得到了发展[22]，如Kozmus等[23]通过翅的结构对19种熊蜂进行了几何形态学鉴定，鉴定准确度达到97%。寻找更多可用于几何形态学鉴定的形态特征或许有利于更准确地进行熊蜂形态学分类。

3.2 三江源地区熊蜂物种多样性水平

在多样性指数、均匀度指数和物种丰富度方面，三江源地区略低于青藏高原其它地区和青藏高原毗邻区。如位于青藏高原东部向黄土高原过度地带的甘肃省，其Shannon-Wiener多样性指数为3.03，Pielou均匀度指数为0.76，物种丰富度为56；位于青藏高原东侧的青海省东部地区，其Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀度指数和物种丰富度分别为2.67，0.85和23.00[2]。这两个地区的三个指标均高于三江源地区(Shannon-Wiener多样性指数为2.15,Pielou均匀度指数为0.71,物种丰富度为21)。这可能因为青藏高原向黄土高原、秦岭山地和四川盆地过渡的地带是世界熊蜂多样性中心，上述两地区比三江源地区更接近多样性中心[7]。而同其它高寒地区相比，三江源地区熊蜂多样性处于较高水平，如Rasmont等[24]在庇里牛斯山脉的高寒地区仅发现7种社会性熊蜂，而本研究记录到18种社会性昆虫。从亚属水平上看，三江源地区有9个亚属，与中国其他地区相比具有较高的多样性水平，如安建东等[13]通过对华北和西北部分地区熊蜂资源的研究发现，京津冀地区、山西省、内蒙古自治区、宁夏回族自治区均只有8个亚属，梁铖等[16]在对云南熊蜂资源的调查中共发现8个亚属，王哲哲[25]在对贵州熊蜂资源的研究中也只发现8个亚属。与青藏高原其它地区相比，三江源地区的熊蜂组成情况存在较大不同。在王磊等[2]对青海省东部地区熊蜂多样性的调查中发现，黑尾熊蜂、红束熊蜂、克什米尔熊蜂和亚洲熊蜂均为优势种(相对丰度Ra≥10%)，稳纹熊蜂为丰盛种(5%≤Ra<10%)；而三江源地区的优势种为克什米尔熊蜂和稳纹熊蜂，红束熊蜂、黑尾熊蜂和亚洲熊蜂分别为丰盛种、常见种(1%≤Ra<5%)和稀有种(Ra<0.1%)；在青海省东部地区相对丰度不足1%的越熊蜂和拉达克熊蜂是三江源地区的丰盛种。这种差异的出现可能与三江源地区的高海拔环境有关，高海拔环境可能更适合克什米尔熊蜂和稳纹熊蜂等高原特有种，较不利于其他种栖息。本研究发现，一些熊蜂在三江源地区具有较高的相对丰度，但其分布范围却较小，一些地理距离较近的地区却具备较低的物种相似性。这种空间组成差异应与环境差异有关。Williams等[17]发现，光照和降水等气候因素与青藏高原不同地区熊蜂组成差异有关；但气候、地理和土壤等因素对熊蜂空间组成差异的相对重要性有待被揭示。

4 结论

本研究通过野外样品采集、形态学鉴定和分子生物学鉴定，系统地调查并分析了三江源地区熊蜂组成情况。共有隶属于9个亚属的21种熊蜂被发现，其中包括一未知种B.sp. SJY-2019。三江源地区物种多样性水平略低于周边地区，但高于其他高寒地区；该地区与周边地区的熊蜂组成差异大，而空间组成差异在三江源地区内的不同区域间也比较明显。