江燕

(广东省城市技师学院 广东广州 510000)

壳聚糖是一种白色无定形、半透明、略带珍珠色的固体。由于原料不同，制备方法不同，相对分子量从几十万到几百万不等。壳聚糖及其衍生物无毒、无害，具有较好的保湿性、渗透性、电解性、降解性、吸附性、吸湿性，使其在农业、食品工业、水处理、纺织、化工、化妆品等领域均有广泛的应用。此外，壳聚糖具有抗菌、杀菌、抗肿瘤、增强免疫力、促进组织修复及止血等生物活性，使其在医药方面具有广泛的应用前景。因此，建立壳聚糖的定量分析方法尤为重要。

目前，国内、外壳聚糖的含量测定方法主要有电化学法、分光光度法、高效液相色谱法、滴定分析法、红外光谱法等。受国内实验条件的限制以及没有壳聚糖纯品，壳聚糖含量的测定仍采用间接测定为主，即先将壳聚糖水解成氨基葡萄糖，再用HPLC-折光测定法或分光度法对单糖定量。该文利用超声波具有空化作用、机械力和热效应作用，用于辅助酸水解壳聚糖生成D-氨基葡萄糖，在碱性条件下与乙酰丙酮反应生成吡咯，然后与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反应生成红色化合物，在波长525 nm 处测定，在标准系列的葡萄糖盐酸质量作为横坐标，对应的吸光度为纵坐标的工作曲线上查得对应的氨基葡萄糖质量，从而间接测定壳聚糖的含量[1]。

1 材料

1.1 材料与试剂

材料：壳聚糖。试剂：盐酸、硫酸、冰乙酸、无水碳酸钠、乙酰丙酮、无水乙醇、4-（二甲氨基）苯甲醛，均为AR。

1.2 仪器与设备

电子天平、水浴恒温振荡器、超声波清洗器、电热恒温鼓风干燥箱、可见分光光度计。

2 方法

2.1 溶液的配制

乙酰丙酮溶液：准确吸取乙酰丙酮2.00 mL，加入1 moL/L碳酸钠溶液至50 mL，置冰箱中备用，应于使用前一日配制。

对二甲氨基苯甲醛溶液：称取4-（二甲氨基）苯甲醛0.8 g，加无水乙醇15 mL及盐酸15 mL，摇匀。

氨基葡萄糖酸的标准溶液：在105 ℃干燥至0.050 0 g氨基葡萄糖酸在50 mL 容量瓶中，溶于水并稀释成水垢，摇匀，去除2 mL，置于100 mL 容量瓶中，加水至水垢中，摇匀。

壳聚糖溶液：称取60 ℃干燥至恒重的壳聚糖0.5 g（准确至0.000 2 g），加入1%的醋酸溶液，待其完全溶解后，定容于100 mL容量瓶中。

2.2 水解壳聚糖

取10 mL 比色管，依次准确地吸取壳聚糖溶液1.00 mL，分别加入一定浓度、体积的盐酸和硫酸，混匀，置于沸水中水浴一段时间，一定温度下超声一段时间，取出冷却至室温，把溶液转移至100 mL容量瓶中，用饱和碳酸钠溶液调节pH 为7.2～7.5，用蒸馏水定量刻度，摇匀，放到一边。

2.3 盐酸氨基葡萄糖标准曲线的绘制

分别移取盐酸氨基葡萄糖的标准溶液0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL置于10 mL比色管中，用蒸馏水稀释至5.00 mL，分别加入乙酰丙酮溶液1.00 mL，摇匀，置于90 ℃水浴静置25 min，取出，迅速用流动水冷却，加入无水乙醇3.00 mL，于60 ℃水浴静置10 min后，再加入对二氨基苯甲醛溶液1.00 mL，用力摇匀后，于60 ℃水浴静置60 min，取出立即用冷水冷却至室温，在波长525 nm处，用1 cm比色皿，以试剂空白为参比液，测其吸光度值。工作曲线以标准系列盐酸氨基葡萄糖为水平坐标，吸光度值为垂直坐标。

2.4 壳聚糖含量的测定

移取壳聚糖水解溶液1.00 mL 置于比色管中，按2.3的步骤测定其吸光度值。

以质量分数表示壳聚糖含量ω1，按公式（1）计算：

式（1）中：m1为由工作曲线查得的盐酸氨基葡萄糖的质量，单位为mg；m为用于测定吸光度的壳聚糖质量，单位为mg；0.746 6 为盐酸氨基葡萄糖折算为壳聚糖的系数。

公式（1）是以盐酸氨基葡萄糖折算为壳聚糖的系数计算壳聚糖含量。

2.5 产率的计算

产率按以下（2）公式计算：

式（2）中：m1为由工作曲线查得的盐酸氨基葡萄糖的质量，单位为mg；M1为盐酸氨基葡萄糖的相对分子质量；m2为用于测定吸光度的壳聚糖质量，单位为mg；M2为壳聚糖的相对分子质量[2]。

3 结果与分析

3.1 盐酸氨基葡萄糖-吸光度标准曲线

在波长525 nm处测定吸光度值，以盐酸氨基葡萄糖质量m为横坐标，单位为mg，对应的吸光度A为纵坐标，绘制盐酸氨基葡萄糖～吸光度标准曲线，得回归方程为A=6.0171m+0.0081，相关系数R2=0.9991。

3.2 水解条件的选择

3.2.1 样品量对壳聚糖含量测定的影响

分别吸取3.00 mg/mL、5.00 mg/mL、7.00 mg/mL、10.00 mg/mL、15.00 mg/mL的壳聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L 盐酸0.80 mL，75%硫酸3.50 mL，摇匀，置于沸水中水浴25 min，取出，置于50 ℃超声60 min，自然冷却至室温，用饱和碳酸钠溶液调节至pH为7.2～7.5，把溶液定容转移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL测定壳聚糖含量。结果显示样品量为5.00 mg时测定壳聚糖含量最高，随着样品量的增加，水解程度逐渐降低。

3.2.2 水浴时间对壳聚糖含量测定的影响

各吸取5.00 mg/mL 的壳聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L盐酸0.80 mL、75%硫酸3.50 mL，摇匀，分别在沸水中水浴10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，取出，置于50℃超声60 min，自然冷却至室温，用饱和碳酸钠溶液调节至pH为7.2～7.5，把溶液定容转移至100 mL 容量瓶中，取1.00 mL测定壳聚糖含量[3]。

结果表明，在实验条件下，随着水浴时间延长，壳聚糖逐渐被水解，当水浴时间达到30 min时，测定的壳聚糖含量最高，随后则有所下降。这是由于随着时间延长，壳聚糖糖苷键逐渐被打断，但在浓酸和长时间高温水解情况下，会出现焦化现象，导致氨基葡萄糖产率下降。

3.2.3 盐酸用量对壳聚糖含量测定的影响

各吸取5.00 mg/mL的壳聚糖溶液1.00 mL，分别加入0.168 mol/L 盐酸0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL，75%硫酸3.50 mL，摇匀，置于沸水中水浴30 min，取出，置于50 ℃超声60 min，自然冷却至室温，用饱和碳酸钠溶液调节至pH 为7.2～7.5，把溶液定容转移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL测定壳聚糖含量。

从试验结果可看出盐酸用量为0.80 mL 壳聚糖含量最高，随着盐酸用量的增加壳聚糖含量显着下降。

3.2.4 硫酸浓度对壳聚糖含量测定的影响

各吸取5.00 mg/mL 的壳聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L 盐酸0.80 mL，分别加入65%、70%、75%、80%、85%的硫酸3.50 mL，摇匀，沸水浴30 min，取出，置于50 ℃超声60 min，自然冷却至室温，用饱和碳酸钠溶液调节至pH 为7.2～7.5，把溶液定容转移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL测定壳聚糖含量[4]。

硫酸浓度越高反应越充分，但同时也伴随副反应的发生，水解产物的碳化也越严重，当硫酸浓度达85%时，溶液呈现为棕褐色，所以选择浓度为70%的硫酸。

3.2.5 硫酸用量对壳聚糖含量测定的影响

各吸取5.00 mg/mL 的壳聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L盐酸0.80 mL，分别加入75%的硫酸2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL摇匀，沸水浴30 min，取出，置于50 ℃超声60 min，自然冷却至室温，用饱和碳酸钠溶液调节至pH 为7.2～7.5，把溶液定容转移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL测定壳聚糖含量。

硫酸用量过少，则体系粘度大，易引起局部焦化且反应不充分；如果用量过高，会给后处理调节pH 值带来困难，综合考虑，硫酸用量为4.00 mL较合适。

3.2.6 超声时间对壳聚糖含量测定的影响

各吸取5.00 mg/mL 的壳聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L盐酸0.80 mL，分别加入75%的硫酸4.00 mL，摇匀，沸水浴30 min，取出，50 ℃分别超声10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60min、70 min、80 min、90 min，自然冷却至室温，用饱和碳酸钠溶液调节至pH为7.2～7.5，把溶液定容转移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL测定壳聚糖含量，结果证明超声时间为70 min 测定壳聚糖含量最高。

3.2.7 超声温度对壳聚糖含量测定的影响

各吸取5.00 mg/mL 的壳聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L盐酸0.80 mL，分别加入75%的硫酸4.00 mL摇匀，沸水浴30 min，取出，分别在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃条件下超声70 min，自然冷却至室温，用饱和碳酸钠溶液调节至pH 为7.2～7.5，把溶液定容转移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL测定壳聚糖含量[5]。

结果证明：提高超声温度略能提高水解反应的速率，但效果不明显；当超声温度超过50 ℃，反而减弱了超声在样品水解中的促进作用。

3.3 壳聚糖含量的测定

采用正交试验得到的优组合条件进行6次平行验证试验，结果测得壳聚糖含量的均值为76.804%，较单因素试验中测得的壳聚糖含量低。分析是由于正交试验所得的最优条件组合只是所选因素及其所取水平范围内得到的结论，这样的条件就所考查的因素和水平而言，可视为最佳条件；但影响壳聚糖含量测定结果的因素较多，并未全部纳入正交试验中进行考察，因此采用单因素试验中的最优条件：样品量2.00 mg，0.168 mol/L 盐酸0.80 mL，75%硫酸3.50 mL，沸水浴30 min，50 ℃超声60 min进行平行验证实验[6]。

该试验测得的壳聚糖含量为82.89%，产率达83.13%，产率较高，其具体情况如表1所示。

表1 平行验证试验（单位：%）

4 结语

该文通过考察样品量、盐酸用量、硫酸用量、硫酸浓度、水浴时间、超声时间、超声温度等因素对壳聚糖水解的影响，确定了适宜的水解条件及工作曲线，并且进行了样品中壳聚糖含量、精密度及加标回收率的测定。试验得到的最佳测定条件为：样品量为2 mg，0.168 mol/L 盐酸用量0.8 mL，75%硫酸用量3.5 mL，沸水浴30 min，50 ℃超声60 min，测定的壳聚糖含量达82.89%，精密度为1.21%，平均回收率为97.7%。同时，通过实验证明采用超声辅助酸水解壳聚糖的测定结果明显高于只用酸水解的测定结果，表明超声波对酸水解壳聚糖有明显的促进作用。试验结果证明，该方法操作简单，测定的准确性和精密度高，采用超声波辅助酸水解壳聚糖具有减少硫酸用量、缩短水浴时间、提高产量等优点，适用于壳聚糖含量的测定。