王喜英 赵辉谭智勇 卢志宏 宋希娟

（铜仁学院，贵州铜仁 554300）

汞（Hg）是一种广泛存在的金属污染物，可在大气中长距离传输，并在环境中持续存在或在食物链中积累（Lima et al.，2019）。在农业生产中，汞化合物已被用作杀虫剂、除草剂和杀菌剂，导致土壤产生严重的局部汞污染（Bryan &Langston，1992）；部分农业措施，如施用化肥、石灰、污泥和肥料等，也是土壤中汞的重要来源（Azevedo &Rodriguez，2012）。汞通过降低植物光合作用、呼吸速率，减少水分、养分吸收以及改变抗氧化酶活性等影响植物代谢（Azevedo &Rodriguez，2012）。在土壤微生物方面，汞会导致蛋白质变性、细胞膜破坏、细胞分裂和酶活性抑制等（Wang et al.，2020a）。研究表明，土壤微生物对重金属胁迫的反应比植物更敏感（Shuaib et al.，2021）。然而，由于汞的形态不同会导致其溶解性、毒性及生物可利用性发生变化，因此其对土壤微生物群落的影响尚未形成共识（Frossard et al.，2017），有必要开展深入的研究。

相关研究认为，土壤重金属污染往往伴随氮元素的匮乏（刘晨 等，2018；孔天乐 等，2020）。生物固氮是指将大气中的N在固氮微生物的固氮酶作用下转化为可被植物吸收利用的含氮化合物的过程，是许多陆地和水生生境中氮元素输入的重要来源（Bellenger et al.，2014）。生物固氮的挖掘和利用，在促进植物生长和影响土壤重金属活性方面发挥着重要作用（刘晨 等，2018）。固氮酶主要由、和基因编码（Gaby et al.，2018）。由于序列高度保守，因此被广泛应用于土壤固氮微生物群落组成及其多样性研究（杨亚东 等，2017）。由于固氮微生物能够快速对重金属污染做出响应，可用作重金属污染的监测和评估指标（孔天乐 等，2020）。

当前，汞已成为菜地污染最严重的重金属之一（崔晓峰 等，2012）。蔬菜作物中，叶菜类蔬菜吸收重金属的风险相对其他种类蔬菜更大（Wang et al.，2020b）。普通白菜在我国各地广泛种植，其对汞的富集作用较强，易对人类健康造成危害（高艺 等，2018）。目前，关于汞的危害研究主要集中在植物生长（刘振京，2019）、酶活性（Zheng et al.，2019）、汞积累（刘忠闯，2016）、土壤养分（Lima et al.，2019）、土壤细菌（Frossard et al.，2017）和真菌（Durand et al.，2020）等方面，而汞对菜地土壤固氮微生物群落结构和丰度的研究鲜见报道。本试验采用盆栽方式，应用荧光定量PCR和高通量测序（Illumina MiSeq）技术对汞胁迫下普通白菜生长及土壤固氮微生物群落结构、多样性和基因丰度进行研究，以期揭示固氮微生物对汞胁迫的响应特征，从固氮微生物角度为汞污染土壤监测和生态风险评估提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021 年1—5 月在铜仁学院塑料大棚内进行。供试土壤采集于贵州省铜仁市碧江区（109°13′12″E，27°47′30″N）的典型菜地黄壤土。从表层0～20 cm 收集新鲜土壤，去除植物残体、砾石等，风干后过2 mm 筛。土壤基本理化性质：有机碳（SOC）含量17.05 g·kg，全氮（TN）含量1.63 g·kg，速效钾（AK）含量46.59 mg ·kg，速效磷（AP）含量16.92 mg·kg，全 汞（THg）含量0.331 mg·kg，pH 值6.56。

供试普通白菜品种为四季小白菜，购自天津市宏丰蔬菜研究有限公司。

以HgCl为汞源，购自铜仁科仪化玻有限公司。

1.2 试验设计

设置4 个汞浓度处理：对照（CK），0 mg ·kg；T1，低浓度，1 mg·kg；T2，中浓度，10 mg ·kg；T3，高浓度，50 mg·kg。每处理3 次重复，每重复1 盆。

分别按比例将汞和过筛土壤混合均匀，装入高21 cm、上口直径21 cm 的塑料盆中，每盆装土5 kg。为保持添加的汞趋于均匀稳定且被土壤充分吸附，土壤老化时间为90 d，期间保持土壤含水量在60%。然后播种普通白菜种子，每盆10 粒，幼苗2片真叶时定苗，每盆留4 株。之后采取常规管理措施，不施用肥料和农药；为避免水中汞进入，均采用蒸馏水浇灌，土壤含水量保持60%。

普通白菜生长60 d 后采收，所有植株均用去离子水冲洗干净，用滤纸吸干表面水分，用于测定生长指标。然后，在普通白菜根系附近选择3 点进行土壤取样，混合成1 个土样，取样量为0.5 kg，去除植物根系并过2 mm 筛后分成2 份，1 份用于铵态氮（NH-N）和硝态氮（NO-N）含量测定，余下部分室内风干后用于土壤全汞含量和基础理化指标测定；1 份保存于-20 ℃冰箱，用于土壤微生物DNA 提取。

1.3 项目测定

1.3.1 普通白菜生长指标测定 使用去离子水将植株根系附着的土壤清洗干净，然后用滤纸吸干水分，利用卷尺和电子天平测定植株的株高、根长、单株鲜质量，取平均值。

1.3.2 土壤全汞含量和基础理化指标测定 全汞含量测定采用王水水浴消解-冷原子吸收光谱法（李仲根 等，2005）；pH 测定采用电位法，有机碳含量测定采用重铬酸钾氧化法，全氮含量测定采用凯氏定氮法，速效磷含量测定采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法，速效钾含量测定采用乙酸铵提取-火焰光度法，铵态氮含量测定采用靛酚蓝比色法，硝态氮含量测定采用酚二磺酸比色法（鲍士旦，2000）。

1.3.3 土壤微生物DNA 提取及基因丰度测定采用DNA提取试剂盒（Omega，GA，USA）提取土壤微生物DNA。利用核酸定量仪（NanoDrop ND-2000）对DNA 浓度和纯度进行检测。荧光定量PCR 在ABI7500 荧光定量PCR 仪（ABI，CA，USA）上进行，扩增引物为-F：5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′和-R：5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCAT CAT-3′（Rösch et al.，2002）。反应体系为：2× SYBR real-time PCR premixture（Bioteke，Beijing）10 μL，上、下游引物（10 μmol·L）各0.8 μL，DNA模板2 μL（1～10 ng），ddHO 补至20 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40 个循环。利用Poly 等（2001）的方法，获得含有基因的重组质粒，分别以10 倍梯度稀释基因重组质粒得到标准曲线，并根据标准曲线计算基因丰度。

1.3.4 固氮微生物高通量测序 采用引物-F与-R 对固氮微生物基因进行PCR 扩增。反应体系为：5× ExTaq 缓冲液5.0 μL，dNPT（2.5 μmol·L）2.0 μL，上、下游引物（10 μmol·L）各1.0 μL，DNA 模板2.0 μL（1～10 ng），ExTaq（5 U·μL）0.25 μL，ddHO 补至25 μL。反 应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 个循环；72 ℃ 7 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 产物送至上海派森诺生物科技股份有限公司，运用Illumina MiSeq 测序平台进行测序。

利用FLASH 软件对通过质量初筛的双端序列根据重叠碱基进行配对连接，从而获得每个样本的有效序列。通过QIIME 软件调用USEARCH 检查并剔除嵌合体序列。将优质序列聚类成操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU），阈值设置为97%，并选取每个OTU 中丰度最高的序列作为该OTU 的代表序列。应用RDP-classifier 在GenBank中对OTU 进行分类注释，统计各样本在门和属水平上的群落组成；使用QIIME 软件，对固氮微生物α 多样性指数进行计算。

1.4 数据处理

采用SPSS 25.0 统计软件对试验数据进行方差分析和显著性检验（＜0.05）。利用R 软件进行土壤固氮微生物群落主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）和冗余分析（redundancy analysis，RDA）。

2 结果与分析

2.1 汞胁迫对普通白菜生长的影响

从表1 可以看出，随着汞浓度的增加，普通白菜株高、根长、单株鲜质量均呈先增加后降低的变化趋势。其中，T1 处理的株高、根长、单株鲜质量均最高，但与T2 处理及对照间差异不显著；而T3 处理的各指标均显著低于T1、T2 处理及对照。表明，低浓度汞对普通白菜生长有促进作用，中、高浓度汞表现抑制作用，且汞浓度越高抑制作用越强。

表1 不同汞浓度对普通白菜生长指标的影响

2.2 汞胁迫对土壤理化性质和全汞含量的影响

从表2 可以看出，随着汞浓度的增加，土壤中全汞含量呈上升趋势，T2、T3 处理与T1 处理及对照间差异显著；全氮和铵态氮含量也呈递增趋势，而硝态氮含量呈递减趋势，T2、T3 处理与对照间差异显著；pH 值先降低后升高，且趋于中性，T3处理显著高于T1、T2 处理及对照。汞胁迫下，速效磷、速效钾含量及C/N 值均降低，各浓度汞处理均低于对照。T3 处理的有机碳含量显著高于T1、T2 处理及对照。

表2 不同汞浓度对土壤理化指标和全汞含量的影响

2.3 汞胁迫对固氮微生物nifH 基因丰度的影响

由图1 可知，不同汞浓度处理的固氮微生物基因丰度变化范围为4.40 × 10～7.91 × 10个·g（干土），表现为T1 ＞ CK ＞ T2 ＞ T3，T3 处理显著低于T1、T2 处理及对照，分别降低了44.33%、40.09%、43.76%。可见，高浓度汞胁迫对固氮微生物基因丰度有显著抑制作用。

图1 不同汞浓度对固氮微生物nifH 基因丰度的影响

为明确汞胁迫下固氮微生物基因丰度的影响因素，将其与土壤理化指标、全汞含量及普通白菜生长指标进行相关性分析。结果表明（图2），基因丰度与pH、铵态氮含量、全汞含量呈极显著负相关关系，与有机碳含量呈显著负相关关系，与硝态氮含量、单株鲜质量、株高、根长呈极显著正相关关系。可知，普通白菜生长对固氮微生物数量有极显著的促进作用。

图2 固氮微生物群落α 多样性指数、nifH 基因丰度与土壤理化指标、全汞含量及普通白菜生长指标的相关性

2.4 汞胁迫对固氮微生物高通量测序结果及其多样性指数的影响

利用Illumina MiSeq 平台对土壤固氮微生物测序分析可知（表3），土壤固氮微生物覆盖率均在99%以上，说明该测序结果能够真实地反映土壤样品中固氮微生物群落特征。T1、T2 处理的有效序列数目显著高于T3 处理，但均与对照差异不显著。随着汞浓度的增加，土壤固氮微生物OTU 数量表现先增加后减少的变化趋势，T3 处理显著低于T1 处理及对照。说明，高浓度的汞胁迫显著改变了固氮微生物OTU 水平上的物种组成。

表3 不同汞浓度对固氮微生物高通量测序结果及α 多样性指数的影响

Chao1 指数和ACE 指数变化趋势一致，均为T1 处理最大，分别为2 020.66 和1 589.80，且均显著高于T2、T3 处理。随着汞浓度的增加，Shannon指数和Simpson 指数均呈现递减趋势，T3 处理显著低于T1、T2 处理及对照，分别下降了7.8%和2.9%、6.9%和2.6%、8.1%和3.1%。说明，低浓度汞胁迫对土壤固氮微生物群落丰富度有促进作用，而高浓度汞胁迫对固氮微生物群落丰富度和多样性有明显的抑制作用。

由图2 可知，土壤固氮微生物ACE 指数、Shannon 指数、Simpson 指数分别与pH、铵态氮含量呈极显著负相关关系，与硝态氮含量呈极显著正相关关系；Shannon 指数、Simpson 指数分别与有机碳含量、全汞含量呈极显著负相关关系，与速效钾含量、株高、根长呈极显著正相关关系；Shannon指数与单株鲜质量呈显著正相关关系；Simpson 指数与单株鲜质量呈极显著正相关关系；ACE 指数与全汞含量呈显著负相关关系，与根长呈显著正相关关系；Chao1 指数与pH、铵态氮含量呈显著负相关关系，与硝态氮含量呈显著正相关关系。

2.5 汞胁迫对固氮微生物群落组成的影响

通过对汞胁迫下土壤样品OTUs 进行归类，得到8 个门、16 个纲、26 个目、48 个科和59 个属。在门水平上，将平均相对丰度＜ 0.1%的类群归类为其他，得到4 个类群（图3-a），分别为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、蓝藻门（Cyanobacteria）和放线菌门（Actinobacteria），其中变形菌门和厚壁菌门不同汞浓度处理间差异极显著，蓝藻门和放线菌门相对丰度可忽略不计。变形菌门（90.71%～93.21%）和厚壁菌门（3.26%～4.64%）为优势菌门，占固氮微生物总类群相对丰度的95.35%～96.50%。变形菌门的相对丰度随汞浓度的增加呈先增加后降低的变化趋势，T3 处理最低，与T1、T2 处理及对照间差异显著；而厚壁菌门的相对丰度表现为随汞浓度的增加而增加，T3 处理最高，分别比T1、T2 处理增加了1.38和1.22 百分点。

在属水平上，得到相对丰度在1% 以上的12 个类群（图3-b），分别为慢生根瘤菌属（）、固氮螺菌属（）、地杆菌属（）、根瘤菌属（）、外红硫螺菌属（）、甲基单胞菌属（）、甲基孢囊菌属（）、、甲基弯曲菌属（）、、和脱硫弧菌属（）。其中慢生根瘤菌属、固氮螺菌属、地杆菌属和根瘤菌属为优势类群，相对丰度分别为29.12%～43.16%、6.76%～10.24%、6.20%～7.40%和4.44%～7.49%。慢生根瘤菌属的相对丰度随汞浓度的增加而逐渐递增，T3 处理最高（43.16%），极显著高于T1、T2 处理及对照，分别是T1、T2处理及对照的1.45、1.21、1.48 倍；汞胁迫对固氮螺菌属的相对丰度表现为抑制作用，随汞浓度的增加其相对丰度逐渐降低，T3 处理最低（6.76%），显著低于T1、T2 处理及对照；地杆菌属和根瘤菌属的相对丰度均以T1 处理最高（7.41%和7.49%），而后随汞浓度的增加而降低，且T2、T3处理间差异显著。说明，汞胁迫对慢生根瘤菌属有促进作用，而对固氮螺菌属表现抑制作用；低浓度汞对地杆菌属和根瘤菌属有促进作用，而高浓度汞则表现为显著抑制作用。

图3 不同汞浓度下固氮微生物门（a）和属（b）水平群落组成

2.6 固氮微生物群落结构及其影响因子分析

通过层次聚类分析可知（图4-a），不同浓度汞处理的固氮微生物群落结构差异明显，T1 和T3处理3 次重复聚类较好；其中，T3 处理与对照、T1 处理与T3 处理间距离较远。PCoA 分析进一步证实了汞胁迫下土壤固氮微生物群落结构的明显差异（图4-b）。PCoA1 和PCoA2 对土壤固氮微生物群落结构变异的解释量分别为33.2%和12.6%。对照、T1 和T2 处理的距离较近，说明这3 个处理之间固氮微生物群落结构相似度较高；T3 处理与其他处理间距离较远，说明高浓度汞处理对固氮微生物群落结构影响较大。

图4 不同汞浓度下固氮微生物群落结构的层次聚类树（a）和PCoA 分析结果（b）

属水平上固氮微生物群落结构与土壤理化指标的冗余分析（RDA）结果表明（图5），RDA1和RDA2 分别解释了固氮微生物群落结构变异的63.40%和14.68%，共解释了总变异的78.08%。土壤pH、铵态氮含量、硝态氮含量和全汞含量对土壤固氮微生物群落结构有极显著影响，有机碳含量和速效钾含量对固氮微生物群落结构有显著影响。

图5 属水平上固氮微生物群落结构与土壤理化指标的冗余分析结果

3 讨论

3.1 汞胁迫对土壤固氮微生物丰度和多样性的影响

前人研究表明，土壤养分、重金属和植物类型等都会影响固氮微生物丰度和群落多样性（王磊 等，2020；Yu et al.，2020）。本试验中，土壤pH、有机碳含量、铵态氮含量、硝态氮含量和全汞含量对固氮微生物基因丰度和群落多样性有显著影响；其中，pH 与基因丰度和群落多样性指数呈显著或极显著负相关关系，与Wang 等（2017a）的研究结果一致。Lin 等（2018）研究认为，酸性土壤pH 增加会抑制固氮微生物生长，导致基因丰度和群落多样性指数降低。低浓度汞处理的普通白菜生长较好，可能是根系分泌的化感物质在土壤中积累，使土壤pH 值降低导致的。铁是固氮过程中许多蛋白质合成所需的重要辅助因子，在酸性土壤中铁的利用率随土壤pH 值的增加而降低（Shuman，1998）。因此，在重金属汞胁迫下土壤pH 值增加可能间接对固氮微生物生长有抑制作用，导致固氮微生物群落α 多样性指数（T1 处理除外）随汞浓度增加而减少。高浓度汞处理的土壤有机碳含量和铵态氮含量显著增加，进而导致固氮微生物丰度和多样性显著降低，这可能是由于汞胁迫造成土壤固氮微生物死亡或群落减少，植株生长缓慢，对土壤养分的吸收利用较少。

本试验结果表明，全汞含量与固氮微生物基因丰度呈极显著负相关，重金属可能严重影响稀有和敏感物种以降低其竞争能力，同时重金属胁迫也诱导活性氧产生，抑制固氮微生物生长（Volkov et al.，2006）。Gans 等（2005）研究表明，在重金属作用下固氮微生物中某些敏感物种竞争能力下降，导致固氮微生物丰度下降。Yin 等（2018）也认为，重金属与固氮微生物基因丰度呈显著负相关，重金属浓度过高会抑制固氮微生物生长。而本试验中，低浓度汞处理的固氮微生物基因丰度高于中、高浓度汞处理及对照，这可能与一些固氮微生物存在汞抗性有关。微生物可以耐受低浓度的重金属，这主要是因为重金属离子从细胞中流出（Nies，1999），能够适应重金属胁迫的微生物占据重要的生态位。因此，在低浓度汞处理时某些耐汞固氮微生物的丰度可能增加。高浓度汞处理的固氮微生物基因丰度显著下降，表明营养限制和汞毒性对固氮微生物产生了影响。Chodak等（2013）研究认为，重金属含量对土壤固氮微生物群落α 多样性指数有显著影响。本试验中，低浓度汞对固氮微生物群落丰富度有促进作用，高浓度汞对固氮微生物群落丰富度和多样性均表现抑制作用。其中，汞对固氮微生物群落丰富度的影响较明显，汞浓度越高影响越大，与Zhu 等（2021）的研究结果一致。在低浓度汞胁迫下，通过竞争性释放次级微生物类群增加了微生物群落丰富度（Liu et al.，2018）。Sun 等（2020）研究认为，在重金属高度污染的地区，缺乏氮等养分会导致固氮微生物富集。Das 等（2013）研究认为，重金属浓度较高会显著抑制植物生长，与本试验结果一致。植物生长旺盛，根系分泌物多，有利于固氮微生物生长和群落多样性增加（杨亚东 等，2017）。本试验中，低浓度汞处理的普通白菜生长较快，根系长，原因可能是其根系分泌物较多，对固氮微生物生长有促进作用，改善了固氮微生物群落多样性。

3.2 土壤固氮微生物群落结构及其与土壤理化指标的关系

土壤生态系统中高浓度重金属污染对微生物群落有显著影响（Zhang et al.，2016）。不同浓度重金属胁迫可能对固氮微生物类群施加不同的压力，导致固氮微生物群落组成的相对丰度显著下降（金属敏感物种）或上升（金属抗性物种）（Liu et al.，2014）。

本试验中，门水平上固氮微生物优势类群以变形菌门和厚壁菌门为主，其次是蓝藻门和放线菌门，与Yin 等（2018）的研究结果相似。变形菌门能够将大气中的氮固定为易于获得的形式，以供植物生长，其广泛存在于各种环境中，且高度多样化（Chen et al.，2019）。前人研究表明，在加拿大安大略省北部的镍、铜矿区，斯洛伐克西南部的镍、钴和锌矿区，变形菌门均为主要微生物类 群（Karelová et al.，2011；Narendrula-Kotha &Nkongolo，2017）。本试验中，变形菌门的相对丰度在对照、低和中浓度汞处理间差异不显著，但均显著高于高浓度汞处理。说明变形菌门对重金属汞胁迫具有一定的耐受性，但超出适应的阈值则导致其数量减少或者死亡。关于变形菌门对汞的耐受能力，相关研究认为变形菌门含有抗性基因，可将汞离子还原为元素汞（Møller et al.，2014）；微生物的活细胞或死细胞可以吸附汞，降低汞毒害（François et al.，2012）；通过外排系统挤出重金属离子，通过含硫醇分子进行分离以及将其还原为低毒性的氧化状态（Harichová et al.，2012）。厚壁菌门可生活在极端环境中，可修复广谱重金属污染，通过分泌有害物质干扰植物氮代谢，抑制植物正常生长（Karelová et al.，2011）。高浓度汞处理的厚壁菌门相对丰度显著高于低、中浓度汞处理及对照，这可能也是致使普通白菜生长缓慢的一个因素。

慢生根瘤菌属是分布广泛的固氮微生物类群，为寡营养细菌，在营养缺乏的条件下也能存活，具有较高的耐汞性（Salmi &Boulila，2021）。随着汞浓度的增加，慢生根瘤菌属相对丰度逐渐增加，这可能是由于慢生根瘤菌属可以产生高水平的胞外多糖，能够捕获重金属离子和阻止它们进入细胞（Dhakephalkar &Chopade，1994）。固氮螺菌属对植物的生长有积极影响，可促进新根形成，增加植株干质量，但对汞污染敏感（Widawati &Suliasih，2019）。随着汞浓度的增加，固氮螺菌属相对丰度逐渐降低，说明汞胁迫对固氮螺菌属生长具有抑制作用。其中，T3 处理固氮螺菌属相对丰度最低，可能是由于普通白菜生长缓慢，通过根系释放的分泌物较少，不利于固氮螺菌属生长。根瘤菌属是高浓度汞污染土壤中的生物标志物，可以耐受一定浓度的汞胁迫（6 mg·kg），对镍和锌等潜在的有毒重金属也具有一定的抗性和解毒能力（Zhu et al.，2021）。低浓度汞处理的根瘤菌属相对丰度高于中、高浓度汞处理，这可能是因为中、高汞浓度超出了该类群的生态阈值。

Zhan 和Sun（2012）研究表明，重金属污染土壤氮含量对固氮微生物群落有重要影响，其中铵态氮和硝态氮含量是影响土壤固氮微生物群落结构的最主要因素（Wang et al.，2017b），与本试验结果一致。本试验中，土壤pH 是固氮微生物群落发生变化的主要因素之一。因为土壤pH 与固氮微生物对土壤养分的吸收和利用密切相关，故可通过调节土壤酸碱度来影响固氮微生物群落（Wang et al.，2010）。

4 结论

本试验结果表明，汞污染不仅影响植物生长，还影响参与固氮的微生物类群。低浓度汞对普通白菜株高、根长、单株鲜质量均表现促进作用，而中、高浓度汞则表现抑制作用。随着汞浓度增加，固氮微生物基因丰度、物种丰富度和多样性指数均呈先增加后下降的变化趋势。在门水平上，变形菌门和厚壁菌门为优势类群；在属水平上，慢生根瘤菌属、固氮螺菌属、地杆菌属和根瘤菌属为优势类群。高浓度汞对变形菌门及固氮螺菌属、地杆菌属、根瘤菌属的相对丰度有抑制作用，对厚壁菌门及慢生根瘤菌属相对丰度有促进作用。土壤pH、铵态氮含量、硝态氮含量及全汞含量对土壤固氮微生物群落结构均有极显著影响，有机碳含量和速效钾含量对固氮微生物群落结构有显著影响。汞胁迫通过影响普通白菜生长、土壤pH 及铵态氮、硝态氮、有机碳、速效钾含量变化，导致固氮微生物群落结构发生变化。