巩婧婷，王远，李先义，罗瑞峰，张金磊，罗小玲

新疆农垦科学院分析测试中心（石河子 832000）

球虫病是一种有极强传染性的肠道寄生虫病[1-2]，由于规模化的养殖、饲养密度大、家禽管理系统不良等因素导致球虫病容易爆发呈常年流行[3-5]。现阶段药物防治球虫病经济成本低、起效快而养殖户所青睐[6-8]。氯苯胍属于胍基衍生物，分子式是C15H14Cl3N5，属于为化学合成抗球虫药。因不良反应轻、易吸收、对急慢性球虫病均有良好效果[9-11]。盐酸氯苯胍是一种难以直接被降解的物质，不规范使用不但会使鸡产生耐药性，而且会影响鸡相关产品品质。长期食用高残留氯苯胍食品可使消费者的身体健康受到伤害[12]。

氯苯胍常用的检测方法有高效液相色谱法[13]、液相色谱-串联质谱法[14-15]等。但液相色谱法耗时长且容易出现假阳性，故选择液相色谱-串联质谱法来提高检测效率和准确性。普通前处理试剂和耗材消耗大，繁琐费时成本高。因此试验拟采用QuEChERS法进行前处理，通过对色谱和质谱条件的优化，建立LC-MS/MS法快速测定鸡肉和鸡蛋中的氯苯胍。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

乙腈、甲醇、甲酸（HPLC级，德国CNW公司）；正己烷（AR，天津市致远化学试剂有限公司）；超纯水；鸡蛋、鸡肉经匀浆机处理后装入样品瓶中置于-20 ℃下冷冻储存备用。

1.2 仪器设备

液质联用仪（Agilent 1200+6460型，美国Agilent公司）；漩涡混合器（MS3 basic，德国IKA公司）；高速冷冻离心机（Multifuge X Pro Series，Thermo Fisher Scientific公司）；超声波清洗器（KQ-600DE型，昆山市超声仪器有限公司）；超纯水仪（IQ7000，美国MilliQ公司）；电子天平[BSA4202S-CW，Sartorius科学仪器（北京）有限公司]。

1.3 标准溶液的配制

购买溶解在甲醇中的盐酸氯苯胍标准品溶液1 000 μg/mL，置于-20 ℃下避光保存。用甲醇将标准品溶液逐级稀释并配制成1，2，5，10，20和50 ng/mL的氯苯胍系列工作溶液，置于4 ℃下避光保存。

1.4 样品预处理

鸡肉去骨、鸡蛋破壳后用匀浆机搅打混匀后准确称取2.00 g鸡肉/鸡蛋于50 mL离心管中，加入20 mL的0.2%甲酸乙睛水（80∶20，V/V）溶液提取，涡旋离心1 min后35 ℃下恒温超声提取15 min；以10 000 r/min高速离心5 min后，取5 mL上清液转移至10 mL离心管中并加入5 mL乙睛饱和的正己烷涡旋30 s后，在5 000 r/min下离心5 min弃去正己烷，加入5 mL正己烷重复操作1遍，向溶液中加入50 mg C18粉末涡旋30 s，以5 000 r/min离心5 min后，经0.2 μm聚四氟乙烯疏水性滤膜过滤装入进样瓶，供HPLC-MS/MS分析。

1.5 HPLC-MS/MS条件

色谱条件：色谱柱ZORBAX SB-AqSolvent Saver Plus（3.0 mm×100 mm，3.5 μm）；柱温30 ℃；流动相组成：0.1%甲酸水-乙睛（梯度）；进样量5 μL；流速0.6 mL/min，梯度洗脱。梯度洗脱程序（见表1）。

表1 以0.1%甲酸水-乙腈为流动相的梯度洗脱程序

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子模式；质谱扫描方式为多反应监测（MRM）；毛细管电压4 000 V，干燥气温度325 ℃，干燥气流量10 L/min，鞘气温度350 ℃，鞘气流速12 L/min。氯苯胍监测离子、碰撞电压和碰撞能量等质谱参数如表2所示。

表2 氯苯胍的质谱参数

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

在电喷雾电离和MRM模式下对10 ng/mL的氯苯胍标准溶液多次注射进样。通过对鞘气的温度、鞘气的流速，毛细管的电压、碰撞电压和碰撞能量等参数进行过优化。选择稳定性好、离子丰度高和干扰小的2个碎片离子作为氯苯胍定性离子和定量离子，并以丰度最强，响应值最高的作为定量离子对。标准溶液质量浓度为10 ng/mL的氯苯胍MRM离子对质谱图（如图1）。

图1 氯苯胍的MRM离子对质谱图

2.2 色谱条件优化

通过比较同一浓度下氯苯胍在水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、5 mmol/L乙酸铵溶液-乙腈5种流动相体系下的峰面积和峰高，结果发现：当流动相为A、B体系时，基线噪音大、峰不对称且拖尾；C体系色谱柱压力高，出峰时间滞后，峰形为双头峰且响应值低；D体系响应高且对称性好；E体系响应值低于D体系。因此，试验选择0.1%甲酸水溶液-乙腈（以D表示）作为检测氯苯胍的流动相体系（如图2所示）。

图2 不同流动相体系对氯苯胍提取效率的影响

2.3 优化提取溶剂

通过试验观察不同提取溶剂的提取效果，在同一提取条件下（添加0.2%甲酸），当提取溶剂中乙腈含量小于60%后提取溶剂浑浊。因此试验对比含0.2%甲酸的乙睛溶液（用A表示）、含0.2%甲酸的乙睛-水（9∶1，V/V）溶液（用B表示）、含0.2%甲酸的乙睛-水（8∶2，V/V）溶液（用C表示）、含0.2%甲酸的乙睛-水（7∶3，V/V）溶液（用D表示）4种乙腈含量不同的溶剂提取鸡蛋和鸡肉中的氯苯胍。结果显示，随着乙睛含量降低，氯苯胍提取效率先升高后降低，质控样回收率在60%～99%。用B溶液提取鸡蛋和鸡肉中的氯苯胍，质控样的回收率分别能达到97.2%和94.6%，高于其他比例溶液的提取效果。因此试验选取含0.2%甲酸酸化的乙睛-水（8∶2，V/V）溶液（用C表示）作为最佳提取溶剂（如图3所示）。

图3 不同提取溶剂对氯苯胍提取效率的影响

2.4 滤膜材质对试验结果的影响

通过比较混合纤维素（MCX）微孔滤膜、尼龙（PA）微孔滤膜和聚四氟乙烯（PTFE）疏水性滤膜，这3种不同材质滤膜对同一质量浓度（50.0 ng/mL）氯苯胍溶剂标的吸附差异如图4所示。装瓶前同时弃去前5滴液体，取0.5 mL上机测定。结果表明，只有聚四氟乙烯疏水性滤膜损失最少，过滤前后上机浓度差异最小，其余滤膜有较大损失。

图4 不同材质滤膜过滤效果

2.5 离子色谱图

按照优化后的质谱条件和色谱条件，对经过前处理后得到的鸡蛋和鸡肉的空白样品、质控样品及基质标进行分析，得到的TIC色谱图（如图5和图6所示）。目标物氯苯胍出峰时间在3.4 min左右，峰形尖锐且对称，基质中在目标峰前后无干扰。由峰面积数值可得，鸡蛋和鸡肉质控样的加标回收率分别是88.5%和91.5%，能满足检测的要求。

图5 鸡蛋中氯苯胍TIC谱图

图6 鸡肉中氯苯胍TIC谱图

3 方法的评价

3.1 线性范围和检出限

通过比较相同浓度下的氯苯胍溶剂标准溶液与空白基质中添加标准溶液峰面积大小，结果发现存在基质抑制效应，故选用空白基质添加标准溶液进行线性范围的验证。在优化条件后对一系列氯苯胍基质添加标准溶液进行测定，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行回归分析。结果表明，氯苯胍在1～50 ng/mL范围内呈现良好的线性关系，鸡蛋和鸡肉中线性相关系数均为（R2=0.999 4）。在信噪比rSN为3时，计算得出氯苯胍的检出限为5 μg/kg；在信噪比rSN为10时，计算得出氯苯胍的定量限为10 μg/kg。该方法线性关系良好（见表3）。

表3 鸡蛋和鸡肉中氯苯胍的线性方程、线性范围、相关系数

3.2 回收率和精密度

任意选取一份空白鸡蛋和鸡肉样品，按照试验方法进行3个浓度加标测定回收率，对各浓度6个平行样品进行分析。试验结果（见表4），鸡蛋中氯苯胍的平均回收率为91.3%～94.1%，相对标准偏差为1.6%～3.0%，鸡肉中氯苯胍的平均回收率为80.3%～93.8%，相对标准偏差为0.1%～1.8%，说明该方法回收率稳定且精密度良好。

表4 鸡蛋和鸡肉中氯苯胍的回收率和精密度

3.3 实际样品的测定

收集新疆地区鸡肉和鸡蛋样品共96个，按照优化后试验条件对鸡蛋和鸡肉样品进行测定。结果显示，所有收集样品中均未检出氯苯胍。

4 结论

采用HPLC-MS/MS质谱法分离。通过对仪器条件优化、前处理环节优化（不同流动相、不同提取溶剂等因素），提高鸡蛋和鸡肉中氯苯胍的提取效率并减少预处理时间。在方法学验证和实际样品测定结果中表明，该方法具有分析速度快，经济成本低的特点，适于鸡蛋和鸡肉中氯苯胍的定性定量检测。