李东红，李雪龙，李晶，矫艳平*，李丽娜，陈雪

1. 江西仁仁健康产业有限公司（樟树 331200）；2. 远大生命科学（辽宁）有限公司（沈阳 110000）

黑枸杞（Lycium ruthenicumMurr）为茄科（Solanaceae）、枸杞属（Lycium L.）多棘刺灌木，果实肉质肥厚，多分布于中国陕西北部、宁夏、甘肃、青海、新疆等地。黑果枸杞味甘、性平，富含蛋白质、枸杞多糖、氨基酸、维生素、矿物质、微量元素、花青素等多种营养成分，其中花青素是最有效的天然水溶性自由基清除剂，具有抗氧化、抗疲劳等功效[1]。桑椹（mulberry）为桑科植物果实，红紫色或黑色椭圆型聚花果，味甜且富含花色苷、黄酮、磷脂、脂肪酸等多种营养成分，具有良好的营养价值和药用功效[2]。食用植物酵素是以可用于食品加工的植物作为原料，添加其他辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的酵素产品。其富含多糖类、矿物质、有机酸、多酚类等生物活性物质，具有促进人体健康的作用，广受消费者喜爱[3-4]。

试验以黑枸杞和桑椹作为主要原料，添加低聚异麦芽糖、低聚果糖，通过益生菌发酵制备黑枸杞本草酵素。低聚异麦芽糖和低聚果糖的添加不仅可以改善产品的口味，且能明显改善肠道内微生物种群比例，是肠内双歧杆菌的活化增殖因子，可减少和抑制肠内腐败物质的产生，抑制有害细菌的生长[5-6]。试验通过优化桑椹添加量、低聚果糖的添加量和发酵时间，获得最佳感官状态，并利用小鼠试验，测试小鼠食用产品后进行运动的肝糖原变化、力竭游泳时间及血乳酸浓度和血尿素氮浓度的变化，对黑枸杞本草酵素抗疲劳效果进行探究，为开发具有抗疲劳的功能性酵素产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑果枸杞（中宁县杞福源商贸有限公司）；桑椹（山东禾谷食品有限公司）；低聚异麦芽糖、低聚果糖（保龄宝生物股份有限公司）；雄性ICR小鼠（18～22 g，辽宁长生生物技术有限公司）；血乳酸检测试剂盒、血尿素氮检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

LDZX-50KBS型高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；DNP-420型培养箱（北京市永久光明医疗器械有限公司）；UPTB-10超纯水机（上海申分分析仪器有限公司）；101A-3电热恒温干燥箱（北京市永久光明医疗器械有限公司）；JA2003N型精密电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；PHS-25B型酸度计（上海大普仪器有限公司）；SW-CJ-2D超净工作台（沈阳鑫科之杰仪器化玻有限公司）；TG1650-WS型台式高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；UV-2000型可见紫外分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司]；PT-3502B 全自动酶标仪（北京普天新桥技术有限公司）；SY-1S型实验室错流膜过滤器（绍兴海纳膜技术有限公司）；MF-1-10型实验室除菌过滤器（绍兴海纳膜技术有限公司）。

1.2 黑枸杞本草酵素的工艺流程

1.3 单因素试验

1.3.1 低聚果糖添加量对黑枸杞本草酵素感官的影响

以黑枸杞和桑椹为原料，选用植物乳杆菌、罗伊乳杆菌、鼠李糖乳杆菌为发酵菌株，确定桑椹添加量2%、发酵时间47 h，低聚果糖添加量分别为1%，2%，3%，4%和5%，以感官质量为质量检测指标，根据黑枸杞本草酵素的感官评分，研究低聚果糖添加量对感官品质的影响。

1.3.2 桑椹添加量对黑枸杞本草酵素感官的影响

以黑枸杞和桑椹为原料，选用植物乳杆菌、罗伊乳杆菌、鼠李糖乳杆菌为发酵菌株，确定低聚果糖添加量3%，发酵时间47 h，桑椹添加量分别为1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%，以感官质量为质量检测指标，根据黑枸杞本草酵素的感官评分，研究桑椹添加量对感官品质的影响。

1.3.3 发酵时间对黑枸杞本草酵素感官的影响

以黑枸杞和桑椹为原料，选用植物乳杆菌、罗伊乳杆菌、鼠李糖乳杆菌为发酵菌株，确定低聚果糖添加量3%、桑椹添加量2%，发酵时间分别为45，46，47，48和49 h，以感官质量为质量检测指标，根据黑枸杞本草酵素的感官评分，研究发酵时间对感官品质的影响[7]。

1.4 黑枸杞本草酵素最佳配方的确定

采用三因素三水平响应面试验，以感官评分为指标，对低聚果糖添加量、桑椹添加量、发酵时间3个工艺参数进行优化，确定最优黑枸杞本草酵素的加工工艺[8]，试验设计见表1。

表1 响应面编码表

1.5 感官评价

选取50人对黑枸杞本草酵素产品进行感官测评[9]，感官评分标准见表2。

表2 感官评分标准

1.6 黑枸杞本草酵素特征性成分

黑枸杞本草酵素的特征性成分多酚、粗多糖及有机酸含量的测定委托谱尼测试集团股份有限公司完成。

1.7 黑枸杞本草酵素微生物指标测定

菌落总数参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》，霉菌参照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》，大肠菌群参照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》。

1.8 抗疲劳功能的试验探究

参照《保健食品检验与评价技术规范（2003年版）》中抗疲劳试验的方法，测定小鼠喂食黑枸杞本草酵素后小鼠负重游泳时间、小鼠血乳酸浓度、尿素氮浓度、肝糖原的变化。

1.8.1 小鼠肝糖原的测定[10]

采用40只雄性小鼠，将小鼠分为4组：对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。每组10只。用已优化制备好的黑枸杞本草酵素按5，10和15 mL/kg，对照组采用等剂量蒸馏水饲喂，试验期为30 d。

30 d试验周期结束后，处死小鼠后取出肝脏，与TCA溶液混合后离心放置，沉淀后再次离心，倒掉上清液，充分振荡后至糖原完全溶解。空白试剂：选取等量蒸馏水加入离心管；标准试剂：选取等量标准液和蒸馏水加入离心管。加入蒽酮试剂，测定其吸光度，根据肝脏质量与肝糖原含量进行换算，测得小鼠肝糖原含量（mg/g）。

1.8.2 小鼠负重游泳试验及测定血乳酸浓度、尿素氮浓度

另选用40只雄性小鼠，将小鼠分为4组：对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。每组10只。用已优化制备好的黑枸杞本草酵素按5，10和15 mL/kg，对照组采用等剂量蒸馏水饲喂，试验期为30 d。

末次灌胃30 min后，在小鼠尾根部负荷5%体重铅皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深不少于30 cm，水温（25±1.0）℃，记录小鼠自游泳开始至死亡时间，即小鼠负重游泳时间。取出小鼠，吹干毛发随后断头取血，分离血清，按照试剂盒法测定血乳酸浓度和尿素氮浓度。

1.9 统计方法

采用SPSS 19.00统计软件进行处理，所有数据均以X±S表示，组间差异方差分析：P＜0.05，差异显著；P＜0.01，差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 黑枸杞本草酵素单因素试验结果

2.1.1 低聚果糖添加量对黑枸杞本草酵素感官的影响选择桑椹添加量2%、发酵时间47 h，考察不同低聚果糖添加量对于产品感官评分的影响。由图1可知，低聚果糖添加量3%时，产品感官评分最高，为93.67分。原料添加黑枸杞、桑椹酸度较高，添加量超过3%时，破坏产品的糖酸比，醇厚度遭到破坏，影响黑枸杞本草酵素的口感和风味[11]，因此选择低聚果糖添加量3%为宜。

图1 低聚果糖添加量对黑枸杞本草酵素感官评价的影响

2.1.2 桑椹添加量对黑枸杞本草酵素感官的影响

选择低聚果糖添加量3%、发酵时间47 h，考察不同桑椹添加量对于产品感官评分的影响。由图2可知，桑椹添加量2%时，产品感官评分最高，为92.00分。这是由于适量的桑椹可以调节饮料的色泽、口感和风味，但过多会导致产品口感酸涩，影响产品的感官评分[12]，因此选择桑椹添加量2%为最佳。

图2 桑椹添加量对黑枸杞本草酵素感官评价的影响

2.1.3 发酵时间对黑枸杞本草酵素感官的影响

选择低聚果糖添加量3%、桑椹添加量2%，探究发酵时间对产品感官评分的影响。由图3可知，在47 h以内，产品感官评分随着发酵时间延长而升高，47 h感官评分最高，为91.33分。由于发酵时间延长，导致发酵过度产生较多乳酸，使得产品口感不佳，感官评分较低，因此选择发酵时间47 h为宜。

图3 发酵时间对黑枸杞本草酵素感官评价的影响

2.2 响应面设计方案及结果

在单因素基础上，对低聚果糖添加量（A）、桑椹添加量（B）、发酵时间（C）进行三因素三水平响应面试验，应用Box-Behnken设计方案，以感官评分为响应值[13-14]，试验结果见表3。

表3 响应面设计方案和结果

2.3 回归模型的建立及方差分析

应用Design-Expert V 8.0.6软件对表3的试验数据进行多元回归拟合，得回归方程Y=92.2+0.88A+0.13B+0.5C+0.25AB+2.5AC+0.5BC-4.73A2-6.23B2-4.47C2。对模型方程进行显著性分析，见表4。

表4 回归模型方差分析

由表4可知，影响无黑枸杞本草酵素感官评分的顺序为低聚果糖添加量＞发酵时间＞桑椹添加量。回归方程模型P=0.001 6，该模型极显著，失拟项P=0.273 5，不显著，说明该回归方程是可行的。模型的决定系数R2为0.940 9，Radj2为0.865 0，表明感官评分的实际值与预测值拟合较好。由此可知，各试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系[15]。

2.4 响应面两两因素交互作用

绘制响应面的交互作用见图4～图6。

由图4可知，发酵时间一定时，低聚果糖添加量与桑椹添加量交互作用不显著。由图5可知，桑椹添加量一定时，低聚果糖添加量与发酵时间交互作用显著，且发酵时间对产品影响较大。由图6可知，桑椹添加量和发酵时间交互作用不显著，感官评分随两种添加物添加量的增加变化较大。利用Box-Behnken设计响应面对试验结果进行优化，得出最佳工艺参数：低聚果糖添加量3%、桑椹添加量2%、发酵时间47 h，模型预测感官评分为92.2分。为验证试验可靠性，选取最优添加量制作黑枸杞本草酵素进行感官评定，取3组平行，感官评分平均值为91.75分，与预测值相符，表明响应面优化黑枸杞本草酵素工艺的可靠性较高[16]。

图4 低聚果糖添加量和桑椹添加量对产品感官评分的影响交互作用

图5 低聚果糖添加量和发酵时间对产品感官评分的影响交互作用

图6 桑椹添加量和发酵时间对产品感官评分的影响交互作用

2.5 黑枸杞本草酵素特征性指标测定

疲劳是人体机能暂时下降的现象，同时是一种普遍存在现象。胡云峰等[17]研究发现，体内能源消耗，且代谢缓慢是造成疲劳的主要因素。活性成分如粗多糖、多酚等物质具有抗氧化、增强免疫力等功效，尤其多糖类物质可分解为能源物质补充能量，起到抗疲劳作用[18]。

选用优化后的配方制作黑枸杞本草酵素，测定特征性指标结果如表5所示。多酚类物质具有较强的抗氧化能力，可提高机体免疫力，黑枸杞本草酵素内多酚含量为16 mg/g，有效成分含量较高。粗多糖含量为0.1 g/100 g，可以为机体提供能源，缓解机体疲劳。有机酸含量为2.4×104g/kg，可以刺激消化腺的分泌，增进食欲，有利于食物的消化，同时调节产品风味。

表5 黑枸杞本草酵素特征性指标测定结果

2.6 微生物指标测定结果

黑枸杞本草酵素微生物指标测定如表6所示。产品内霉菌未被检测出，大肠菌群均小于10 CFU/mL，菌落总数检测结果未被检测出。由结果可知，产品检测结果均符合标准。

表6 黑枸杞本草酵素微生物指标测定结果

2.7 小鼠肝糖原测定

将经过工艺优化的黑枸杞本草酵素对试验小鼠进行饲喂，测定小鼠肝糖原的变化。肝糖原的含量可以间接反映出小鼠机体疲劳状态，因为在运动时体内肝糖原转化为能源，使小鼠血糖保持平衡，且肝糖原储藏量越大，小鼠运动能力越强，抗疲劳能力越强[19-20]。小鼠体能肝糖原变化见图7。

由图7可知，低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠的肝糖原含量分别为35.44，60.87和81.13 mg/g，均高于对照组11.02 mg/g，且喂食小鼠黑枸杞本草酵素的剂量越高，小鼠肝糖原含量越高，小鼠体内可供能量越大，疲劳耐受力越强，抗疲劳能力越强，说明服用黑枸杞本草酵素对于抗疲劳有一定的作用。

图7 不同剂量黑枸杞本草酵素对小鼠肝糖原的影响

2.8 小鼠力竭游泳时间结果

抗疲劳直接的体现为运动耐力提升，游泳时间的长短可以反映小鼠疲劳程度[21]。由表7可知，与对照组相比，低剂量组小鼠游泳时间为413.72 s，明显升高。高剂量组小鼠与低剂量组小鼠相比差异性显著，且明显升高，表明黑枸杞本草酵素对小鼠负重能力有显著提升作用。

表7 黑枸杞本草酵素对小鼠力竭游泳时间影响

2.9 小鼠血乳酸浓度、尿素氮浓度结果

在机体运动过程中，组织器官代谢功能加强，糖酵解反应产生乳酸，使机体感到疲劳。研究发现体内乳酸含量与疲劳程度呈正相关，血乳酸水平反映机体疲劳程度[22]。黑枸杞本草酵素对小鼠血乳酸浓度影响如表8所示。与对照组相比，黑枸杞本草酵素显著降低小鼠内部血乳酸浓度，其血乳酸浓度由10.75 mmol/L下降到6.13 mmol/L，下降率达到42.98%。说明黑枸杞本草酵素可加快产物的消化代谢，降低乳酸含量。

机体剧烈运动时，体内糖原和脂肪不能满足机体需要，此时需要消耗蛋白质作为能源补给，蛋白质的代谢产物血尿素氮浓度会随之增加，血尿素氮浓度越高，表明机体越疲劳[23]。黑枸杞本草酵素对小鼠血尿素氮浓度影响如表8所示。与对照组10.01 mmol/L相比，高剂量组血尿素氮浓度为7.20 mmol/L浓度显著降低，下降率可达28.07%。说明黑枸杞本草酵素能减缓机体分解蛋白质速度，提高机体抗疲劳能力。

表8 黑枸杞本草酵素对小鼠血乳酸浓度、尿素氮浓度影响 单位：mmol/L

3 结论

试验以黑枸杞和桑椹为原料，经益生菌发酵，以感官评分为监测指标，通过单因素试验和响应面试验优化出黑枸杞本草酵素原辅料桑椹、低聚果糖添加量和发酵时间的最优参数，即桑椹添加量2%、低聚果糖添加量3%、发酵时间47 h，优化后的黑枸杞本草酵素产品清澈透亮，香气醇厚，口感纯正且回味甘甜，状态均匀。经特征性指标测定黑枸杞本草酵素产品中含有较高的有机酸、粗多糖和多酚含量。经动物试验表明，黑枸杞本草酵素具有明显的抗疲劳作用，具有广阔的应用发展前景。