宋金益，胡海洋

（中国药科大学，江苏 南京 211198）

自2009年第一个单细胞转录组测序（Single-cell RNA sequenc ing，sc RNA-seq）技术问世以来[1]，对单个细胞的遗传物质进行测序已日渐成为生物医学研究的新范式。基于整个转录组的大量数据，scRNA-seq以极高的分辨率提供了有关基因表达及其调控的全面信息，从而能够精准地描述细胞类型和状态。近几年，随着单细胞转录组测序技术在灵敏度和精确性方面不断被改良，不仅可以更高效、更低成本地提供全面的生物信息，同时也使更精确地解析单个细胞的增殖分化、衰老以及病变过程成为现实。单细胞组学技术的革新正在带来一场细胞检测、分类和鉴定的方法学革命，其应用范围从早期胚胎发育扩大到组织器官发育、神经系统、免疫和肿瘤等多个重要领域。

1 单细胞转录组测序技术原理

单细胞转录组测序基本流程可以概括为单细胞捕获、mRNA提取与逆转录、cDNA扩增、测序文库构建、测序、数据分析等。目前，主流的单细胞测序平台包括10X Genomics Chromium、Nadia（Dolomite Bio）、BD Rhapsody Single-Cell Analysis System、Illumina Bio-Rad、Fluidigm C1等。虽然scRNA-seq的新平台仍在不断涌现，但使用最广泛的平台仍然是基于Drop-seq测序技术的10X Genomics Chromium[2]，其测序流程如图1所示。具体如下：从组织中分离细胞，制备单细胞悬液；将每个细胞与具有明显条形码的微珠共同封装在纳升级液滴中；分离液滴，裂解细胞；微珠捕获细胞的mRNA，形成STAMPs（Single-cell Transcriptomes Attached to Microparticles)；在一个反应中逆转录、扩增和测序数千个STAMP；使用Barcode获取每个转录本的细胞来源。

图1 高通量单细胞转录组测序（Drop-seq）工作流程

2 单细胞转录组技术的发展与革新

2.1 单细胞测序技术与方法学开发

吴昊等[3]开发的scNT-seq（single-cell metabolically labeled new RNA tagging sequencing）技术可以大规模并行分析来自同一细胞的已存在和新转录mRNA。CAO等[4]开发的sci-fate可以用于研究单细胞转录组的动态基因表达。MOUDGIL等[5]介绍了一种在不同细胞系以及小鼠体内可以同时捕捉基因表达和转录因子结合位点的单细胞测序方法scCC（single-cell calling cards）。

DUAN等[6]开发了基于人工智能度量学习的单细胞类型鉴定新方法scLearn。NITZAN等[7]首次利用生物学假设和数学优化模型，提出完全独立于参考数据的单细胞空间位置从头推断策略。MA等[8]介绍了一种scRNA-seq差异表达基因和基因富集联合分析的计算方法iDEA。LANGE等[9]建立了包括再生、重编程以及疾病发生过程等发展方向未知的单细胞命运映射工具CellRank。

2.2 单细胞染色质可及性技术与单细胞空间转录组技术

在单细胞水平分析染色质可及性可以提供复杂组织内细胞类型组成和细胞间变异的关键信息。LI等[10]开发了基于流式分选并利用荧光标记转座酶插入细胞染色质的测序方法 ftATAC-seq（fluorescent tagmentation-and FACS-sorting-based scATAC-seq）。陈曦等[11]详细描述了一项基于流式细胞分选和384孔板的单细胞染色质可及性技术。

BODENMILLER等[12]使用大规模高维单细胞质谱成像分析技术，确定了肿瘤和基质单细胞的表型、组织和异质性，并能够根据细胞组成和组织来表征乳腺癌组织的细胞结构。BAYRAKTAR团队[13]开发的新工具Cell2location可对不同组织结构进行精细空间转录组分析。

2.3 单细胞谱系示踪技术

除了探索单细胞的分子特征，采用单细胞测序技术还能通过谱系示踪研究细胞的正常或疾病状态[14-15]。PEI等[16]报告了人工DNA重组基因座，即Polylox条形码，成功实现在高分辨率水平重建细胞发育轨迹以及在克隆水平揭示细胞发育命运。2020年，PEI等[17]在Polylox系统的基础上，将DNA条形码表达为RNA条形码，实现了在单细胞水平整合细胞谱系信息与基因表达信息。

2.4 单细胞转录组与多组学结合

将RNA杂交、蛋白质免疫组织化学、原位测序、质谱等技术与单细胞空间转录组、蛋白组学等进一步整合，可以在时间和空间上实现对细胞状态的检测[18]。

任兵团队[19]报道了利用Methyl-HiC技术可使DNA甲基化与染色质结构测定同步进行成为现实。MIMITOU等[20]开发了一种能够同时检测单细胞蛋白质水平和染色质可及性的方法PHAGE-ATAC。任兵团队[21]开发了单细胞多组学技术Paired-Tag，利用该技术可在单个细胞中对组蛋白修饰和转录组进行联合分析。YANAI等[22]将基于微阵列的空间转录组方法和单细胞转录组2种技术结合起来，并将多模式交叉分析应用于原发性胰腺肿瘤。

3 基于单细胞转录组技术的应用革新

3.1 大规模组织器官图谱

郭国骥等[23]利用简单低成本的Microwell-seq高通量单细胞测序平台，对来自小鼠的40万个细胞进行了单细胞转录组分析，构建了首个哺乳动物细胞图谱。这一单细胞组学领域里程碑式的研究成果，推动了单细胞测序在基础科学领域的普及。2020年，郭国骥团队[24]又对60种人体组织类型的样本进行高通量单细胞测序分析，系统地绘制了包含8大系统的人类细胞图谱，同时对人和小鼠的景观进行了单细胞比较分析，确定了保守的遗传网络。

3.2 神经系统领域的应用革新

大脑皮层是高级认知的中枢，是人类进化过程中大脑中扩张和多样化最多的区域。SESTAN等[25]通过跨物种单细胞数据整合分析、免疫染色分析以及重新分析已发表的数据，证明了成年人脑中神经元生成非常罕见甚至并不存在。KRIEGSTEIN团队[26]利用单细胞测序，通过分析神经发生的高峰阶段和早期胶质发生期间的10个主要大脑结构和6个新皮质区域，揭示了不同皮层区域不同细胞纵向发育的分子图谱。现有的人类脑细胞图谱还未涉及脑血管系统，而脑血管疾病是引发死亡和神经功能障碍的重要原因，NOWAKOWSKI团队[27]通过分析约18万个细胞的转录组，成功绘制了成人脑血管系统的细胞图谱。

3.3 免疫学领域的应用革新

钱俊斌等[28]绘制了一份全面的COVID-19肺炎免疫图谱，通过分析患有轻度或危重疾病的COVID-19患者的支气管肺泡灌洗样本以及非COVID-19肺炎患者样本，为区分COVID-19特异性相关免疫变化的肺局部炎症信号提供参考。CD8+T细胞是杀伤癌细胞的最主要细胞类群，但在肿瘤发生过程中，这些T细胞呈现功能失调状态，即T细胞耗竭。张泽民团队[29]对来自300多名患者的21种癌症类型的T细胞进行测序，确定了不同T细胞类型转录物组成的差异。

3.4 在发育生物学和胚胎学领域的应用革新

在人类妊娠早期，子宫黏膜转变为蜕膜，胎儿胎盘被植入其中，胎盘滋养层细胞与母体细胞混合并交流；滋养层-蜕膜相互作用异常是妊娠常见疾病的基础，包括先兆子痫和死产。英国剑桥桑格研究所[30]通过单细胞测序分析了来自孕早期胎盘的约7万个单细胞转录组与相匹配的母体血液和蜕膜细胞的转录组，构建了人类蜕膜-胎盘的详细分子和细胞图谱。LUNDEBERG等[31]以受孕后10周内的3个发育阶段的人类心脏样本为研究对象，综合利用单细胞转录组测序、空间转录组测序和RNA原位杂交等实验技术以及细胞空间概率分型的计算方法，首次从全器官尺度绘制了人类心脏发育的单细胞基因表达空间图谱。CAMP团队[32]成功绘制了呼吸道和胃肠道的多个发育中内胚层器官的单细胞转录组图谱。ROY等[33]通过比较来自5个不同组织的57 489个造血干/祖细胞，跨越人类一生的4个发育阶段，揭示了人类发育过程中肝脏和骨髓的造血干/祖细胞的高分辨率单细胞转录组图谱。

汤富酬团队[34]在人类胚胎和胎儿发育过程中对4个皮质叶和脑桥进行了单细胞转录组分析，系统鉴定了人类胚胎发育关键阶段的8种主要细胞类型及其亚型。MICHAELA等[35]综合利用scRNA-seq、空间转录组和原位测序技术，系统地描述了在妊娠前3个月3个发育阶段的人类心脏的空间原型和细胞异质性。MEISTERMANN等[36]明确人类胚胎中谱系规范事件的精确时间以及相关的转录组学和细胞命运标志物。

3.5 肿瘤领域的应用革新

单细胞测序技术已被广泛应用于癌症领域，揭示了肿瘤驱动基因突变、克隆进化、侵袭和转移的潜在机制。LOCASALE课题组[37]首次通过单细胞测序数据解析了黑色素瘤和头颈癌微环境中的代谢基因表达图谱，并确定了不同免疫和基质细胞亚型的代谢特征。MAYNARD等[38]首次在单细胞转录组层面上对肺癌患者在治疗之前和治疗期间的肿瘤样本进行了横向及纵向对比，产生的癌症和肿瘤微环境单细胞图谱揭示了丰富而动态的肿瘤生态系统。ZHANG等[39]对结直肠癌患者的免疫和基质细胞进行了单细胞测序分析，同时对人和小鼠关键骨髓亚群进行综合分析，确定了调节肿瘤免疫的关键细胞间的相互作用，并揭示了目前正在进行临床试验的骨髓靶向免疫疗法的潜在机制。

张泽民团队[40]对跨组织分布的肿瘤浸润淋巴细胞的组成、谱系和功能状态的鉴定，有助于进一步了解肺癌中T细胞的功能状态和动力学。MERAD等[41]综合利用scRNA-seq、CITE-seq和TCR-seq技术，对35个非小细胞肺癌病人的病灶肿瘤与非肺部组织进行分析，成功构建了早期肺癌免疫反应细胞图谱。阎新龙团队[42]明确了人类肝内胆管癌的肿瘤间异质性，强调肝内胆管癌细胞和血管癌相关成纤维细胞之间的细胞间通信的重要性，同时揭示了潜在的治疗靶点。MILES等[43]对髓系恶性肿瘤患者样本进行了单细胞突变分析，对髓系细胞的恶化机制以及克隆复杂性在疾病进程中的变化进行了阐述。

4 总结与展望

利用单细胞测序技术可准确度量单个细胞内生物信息，技术的不断革新进一步推动了单细胞水平的生理过程和病理机制的解析与发现，从而为寻找新的诊断标志物或新的治疗靶点提供重要基础，也为提高疾病的诊断和治疗水平提供潜在的实践依据。

本综述介绍了单细胞转录组测序技术的原理、测序技术的革新以及不断涌现的单细胞测序新技术，如单细胞染色质可及性测序、空间转录组测序和单细胞谱系示踪技术等；同时涵盖了单细胞测序方法在神经系统、发育生物学、胚胎学、免疫学和肿瘤领域等方面的创新性应用，凸显了单细胞测序技术在高度异质性单细胞研究中的巨大优势。与此同时，单细胞测序技术仍存在操作烦琐、检测成本高等实际问题，限制了技术被更广泛应用与推广。此外，单细胞测序领域在从单细胞数据分析中获取生物信息内容和质量等方面仍然有需要克服的技术和计算限制，同时单细胞多组学分析的应用仍处于早期阶段，仍有许多方向有待探索，并且有相当多的发展机会。