刘 珍 罗永金,2 胡晓霞

(1 广西壮族自治区人民医院妇科，广西南宁市 530000； 2 广西医科大学临床医学院，广西南宁市 530021)

宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，高危型人乳头瘤病毒感染已明确是其病因之一。尽管在过去几十年里，宫颈癌的诊断和治疗技术有很大进步，但其发病率和死亡率仍高居女性癌症发病率的第四位，仅2020年全世界就有新发宫颈癌604 127例，有341 831人因宫颈癌死亡[1]。手术和放化疗是治疗宫颈癌的主要手段，分期较晚、肿瘤复发和转移是影响宫颈癌患者预后的主要因素[2]，早发现、早治疗对于改善宫颈癌患者的预后至关重要。因此，进一步探索宫颈癌诊断和治疗的靶点有重要意义。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A)基因的缺失可通过负反馈导致细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)4、CDK6的活性增加，从而促进细胞周期进程[3]。CDKN2A基因异常表达或启动子区过度甲基化在肿瘤的发生、发展中可能起着至关重要的作用[4-6]。本研究采用生物信息学技术分析CDKN2A基因在宫颈癌组织中的表达情况及其与宫颈癌患者临床病理特征、预后、肿瘤免疫细胞浸润的关系，并通过绘制蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析、分析CDKN2A基因启动子的甲基化水平和上游miRNA，来探讨CDKN2A基因在宫颈癌中的可能作用机制，为进一步研究宫颈癌的诊断和治疗方法提供新思路。

1 资料与方法

1.1 数据来源 从GEO数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载同时含有宫颈癌组织与正常宫颈组织基因表达的芯片GSE7803、GSE64217和GSE63514用于筛选差异性表达基因，然后分别采用GPL96、GPL10558和GPL570平台采集芯片数据。

1.2 基因筛选及验证 利用GEO数据库自带软件包GEO2R对芯片(GSE7803、GSE64217和GSE63514)数据进行差异性表达基因的筛选，基因筛选标准为|log2FC|>1且adj.P值<0.01；再利用Venn Diagram在线工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制韦恩图，对筛选出的差异性表达基因取交集，获得共同的差异性表达基因。利用GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)验证CDKN2A基因在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达水平。

1.3 差异性表达基因的通路富集分析 针对共同的差异性表达基因，利用DAVID 在线工具( https：//david.ncifcrf.gov/)分析差异性表达基因的KEGG的通路富集情况。

1.4 构建PPI网络 将3个芯片的差异性表达基因导入STRING数据库 (www.string-db.org/)，提取含有差异性表达基因的文件；再将获得的文件导入Cytoscape软件(Vision 3.8.2)，通过软件中的Cytohubba插件预测和查找基因的重要节点和子网络，利用其中的MCC算法，在差异性表达基因编码蛋白中筛选与CDKN2A基因编码蛋白相互作用密切的蛋白，得到PPI网络。

1.5 CDKN2A基因表达与宫颈癌患者临床病理特征、预后的关系及宫颈癌组织中 CDKN2A基因启动子甲基化水平 利用 UALCAN在线工具( http://ualcan.path.uab.edu/cgi-bin/ualcan-res.pl)下载TCGA数据库中宫颈癌鳞状细胞癌患者基因的表达数据， 分析CDKN2A基因在不同临床病理特征宫颈癌患者中的表达情况，其中临床病理特征包括患者体重、年龄、肿瘤分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况；分析不同CDKN2A基因表达水平宫颈癌患者的生存期差异；分析宫颈癌组织中CDKN2A基因启动子区域甲基化水平。以P<0.05为差异具有统计学意义。

1.6 CDKN2A基因表达水平与免疫细胞浸润的关系 利用TIMER数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析宫颈癌中CDKN2A基因表达水平与各类型免疫细胞浸润水平的相关性，包括B淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞。

1.7 上游miRNA的筛选 利用在线软件ENCORI(https://starbase.sysu.edu.cn)和mirDIP(http://ophid.utoronto.ca/mirDIP)分析与CDKN2A基因有结合靶点的miRNA，利用Venn Diagram在线工具绘制韦恩图，获取两个软件均能预测到的miRNA交集。

2 结 果

2.1 CDKN2A基因在宫颈癌组织中的表达情况 从数据集GSE7803、GSE64217和GSE63514中分别得到差异性表达基因919个、4 324个和3 845个，经过Venn Diagram在线工具取交集后获得347个共同差异性表达基因 ，其中CDKN2A基因在3个基因芯片数据中均显示为上调基因，见图1。经GEPIA数据库验证，CDKN2A基因在宫颈鳞状细胞癌组织组织中呈高表达水平(P<0.05)，见图2。

图1 3个数据集筛选出的差异性表达基因的交集

图2 GEPIA数据库验证结果

2.2 KEGG通路富集分析结果 针对347个差异性表达基因进行KEGG通路富集分析，发现CDKN2A基因参与了细胞周期信号通路、p53信号通路及膀胱癌信号通路，见表1。

表1 CDKN2A基因参与的KEGG信号通路及其他参与基因

2.3 PPI网络分析结果 利用Cytoscape软件中Cytohubba程序进行分析，发现共有22个蛋白与CDKN2A基因编码蛋白存在密切的相互作用，见图3。

图3 CDKN2A基因编码蛋白与其他差异性表达基因编码蛋白的相互作用

2.4 CDKN2A基因表达情况与宫颈癌患者临床病理特征、预后的关系 与淋巴结转移阴性宫颈癌患者相比，淋巴结转移阳性宫颈癌患者的CDKN2A基因表达水平更高(P=0.035)，但在不同肿瘤分期、体重、年龄及肿瘤分化程度患者之间，CDKN2A基因表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)，见图4。CDKN2A基因高表达水平的宫颈癌患者的生存期短于低表达者(P=0.024)，见图5。

图4 图4 不同临床病理特征宫颈癌患者之间 CDKN2A基因的表达情况

图5 CDKN2A基因高表达水平与低表达水平宫颈癌患者的生存曲线比较

2.5 宫颈癌组织的CDKN2A基因启动子区域甲基化水平 宫颈癌组织中CDKN2A基因启动子区域甲基化水平较正常宫颈组织升高(P=0.008)，见图6。

图6 宫颈癌组织的CDKN2A基因启动子区域甲基化水平

2.6 CDKN2A基因与肿瘤免疫细胞浸润的相关性 CDKN2A基因的表达水平与巨噬细胞浸润水平呈负相关，与中性粒细胞、树突状细胞浸润水平均呈正相关(均P<0.05)，见图7。

图7 CDKN2A基因表达水平与巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞浸润水平的相关性注：横坐标代表浸润水平，纵坐标代表CDKN2A表达水平

2.7 上游miRNA的筛选结果 通过ENCORI和mirDIP软件分析，分别得到90个和318个可能与CDKN2A基因有结合靶点的miRNA，取交集后获得9个miRNA，分别为hsa-miR-4436a、hsa-miR-449a、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-1286、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-4319、hsa-miR-506-3p。

3 讨 论

虽然近几年宫颈癌的筛查和治疗手段不断发展，但宫颈癌仍是发病率最高的女性生殖道恶性肿瘤[7]，严重威胁女性的生命健康，宫颈癌新的诊断和治疗方法仍有待进一步研究。与根治性手术、放射治疗、化学治疗等传统的治疗方法相比，宫颈癌基因靶向治疗是一种新的治疗方法，通过对宫颈癌患者实施基因治疗能够有效抑制宫颈癌细胞的生长[8]。因此，寻找与宫颈癌发生和发展相关的关键基因具有重要意义。我们根据GEO数据库的3个宫颈癌基因芯片信息整合结果及GEPIA软件的验证结果，发现CDKN2A基因在宫颈癌组织中呈高表达；通过UALCAN在线工具对TCGA数据库提供的数据进行分析后发现，宫颈癌组织中CDKN2A基因表达水平升高时宫颈癌患者淋巴结转移可能性大，且患者的预后更差，这表明CDKN2A基因可能在宫颈癌的发生及发展过程中起着重要作用，是宫颈癌患者预后评估的潜在分子标志物。

研究表明，免疫细胞的浸润与肿瘤的发生、发展息息相关，许多肿瘤不良预后相关基因的表达水平与肿瘤免疫细胞的浸润有关[9-10]。免疫治疗已成为宫颈癌治疗的新手段。因此，我们利用TIMER数据库进行分析，发现CDKN2A基因表达水平与肿瘤免疫细胞浸润相关，其中与巨噬细胞浸润水平呈负相关，与中性粒细胞、树突状细胞浸润水平均呈正相关(均P<0.05)，这或可为研究宫颈癌的免疫治疗提供新的线索。

本研究中，我们从多方面进一步探讨CDKN2A基因的作用机制。蛋白质的功能主要是通过与其他蛋白质相互作用来实现的，因此我们构建了CDKN2A基因编码蛋白的PPI网络，发现CDKN2A基因编码蛋白与多个基因编码蛋白之间存在相互作用，其中已有研究报告CCNE1可以促进宫颈癌的进展[11]。通过研究此网络中与CDKN2A关系密切的关键蛋白，或可为探索CDKN2A在宫颈癌中的作用机制提供新线索。同时，我们进行了KEGG信号通路分析，结果显示CDKN2A基因参与了细胞周期信号通路、p53信号通路及膀胱癌信号通路。研究表明，CDKN2A基因是一个细胞周期依赖的蛋白，编码细胞周期抑制剂蛋白p16和p14，可与 CDK4、CDK6 结合，形成具有激酶活性的复合物，从而阻断该复合物对Rb蛋白磷酸化，导致细胞周期停止在G期，从而抑制细胞的增殖[12]。此外，DNA甲基化是癌症发生和发展过程中常见的早期分子遗传学变化。已有研究表明在多种肿瘤细胞中CDKN2A基因启动子过度甲基化导致CDKN2A基因突变，从而影响肿瘤的进展，如胰腺癌、胃癌、食管癌等[3，5，13-15]，但在宫颈癌中暂无此类研究。因此，我们利用UALCAN在线工具提取TCGA数据库中的数据进行分析，发现宫颈癌组织中CDKN2A基因的启动子区域甲基化水平升高。这提示宫颈癌的发展可能受CDKN2A基因的启动子区域甲基化水平的影响，但具体调控机制仍需进一步研究。

miRNA广泛参与基因转录后水平的调控，是肿瘤领域研究的热点，其主要通过靶向调控靶基因mRNA的3′末端非翻译区参与细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡等重要生物学过程[16]。本研究结果显示，CDKN2A基因可能与9个miRNA存在结合靶点，推测CDKN2A基因可能受上游miRNA的调控发挥生物学功能。但这些miRNA与CDKN2A基因表达的相关性及结合靶点仍需进一步实验研究验证。

综上所述，宫颈癌组织中 CDKN2A基因呈高表达水平，且与患者淋巴结转移、疾病预后、肿瘤免疫细胞浸润有关，其可作为宫颈癌诊断及预后评估的潜在分子标记物，并可为研究宫颈癌的免疫治疗提供新线索；此外，CDKN2A基因可能通过启动子区域甲基化和上游miRNA调控发挥生物学功能，这为进一步研究宫颈癌的诊断和治疗方法提供了新思路。