江煜灵，汤志成，袁 红，黄木清

（1. 东莞市公安局，广东 东莞 523000；2. 广州高盛智造科技有限公司, 广州 510664）

刑事案件现场遗留的生物物证日趋微量，且常混有泥灰、油污等杂质（抑制物），从而使相关DNA提取的难度加大，故成功提取检材的DNA模板就成为检验的关键环节。目前有多种微量DNA的提取方法，最常用的包括Chelex-100法、磁珠法、硅珠法、硅膜法、直扩法等。这些方法在实际应用中对检材具有一定的针对性，不同种类的检材采用不同的方法其提取效果是不同的，且不同方法的自动化实现程度也差异较大。

磁珠法作为目前主流的DNA提取方法，由于其提取灵敏度较高，对抑制物的去除能力较强且易于自动化，故得到了广泛的应用[1-2]。硅珠法在脱落细胞等微量生物检材以及骨骼、牙齿等疑难生物检材提取中的成功应用亦为很多学者所肯定[3-4]。但由于硅珠不易富集，需人工离心操作才能避免洗涤过程所导致的较大DNA损失，故使得硅珠法的自动化研发较慢[5]。X-Pure 96 Plus工作站内置有离心机，集成了硅珠法和磁棒式磁珠法两种提取方法，对检材的适应性因而得以增强。本研究通过模拟样本测试及案件检材检验，评价该工作站在DNA提取质量和效率上的应用效能。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

TraceMag微量DNA磁珠纯化试剂盒（磁棒式）、TraceSili微量DNA硅珠纯化试剂盒、X-Pure 96 Plus微量DNA自动提取工作站（高盛智造，中国），Promega PowerPlex21试剂盒（Promega，美国），全自动96道微量DNA提取工作站（博坤生物，中国），ABI-Veriti96 Well Fast Thermal Cycler扩增仪、ABI-3500xl遗传分析仪（Life Technologies，美国）。

1.2 材料

采集志愿者新鲜血液5 μL加入4 995 μL无菌纯水配制成一份千倍稀释血；吸取10 μL Promega PowerPlex21试剂盒中所带的2 800M（浓度为10 ng/μL）样品，加入990 μL无菌纯水配制成一份浓度为0.1 ng/μL的标准DNA溶液；测试杂质包括：铁锈（生锈铁器上刮取）、果汁（果粒橙饮料常温放置两天后备用）、蓝色牛仔裤布条、油污（机动车发动机油）、白色墙灰、地上泥灰。

案件检材细分为3类：1）手足接触类：手印、脚印、汗斑以及作案工具上采集的擦拭物或粘取物等；2）口腔接触类：瓶口拭子、吸管拭子、食物残渣、口罩等；3）随身衣物类：衣裤、帽子、手套、皮带、眼镜等。

1.3 样品提取、扩增及电泳分析

样品制备后，按照相关纯化试剂盒各自说明书经工作站进行提取，洗脱体积皆设定为50 μL；使用Promega PowerPlex21试剂盒进行扩增，扩增体系为10 μL，体系配比为Primer∶Mix∶H2O∶DNA模板=2∶2∶1∶5，进行29个循环扩增；使用ABI-3500xl遗传分析仪进行电泳分析，上样缓冲液体系为Hi-Di™甲酰胺∶内标（liz500）＝10∶1，每孔加入10 μL缓冲液+1 μL扩增产物，进样时间15 s，电泳电压1.2 kV。

1.4 检材的检出及平均峰高

判定标准：1）内标峰标定正确，Ladder每个基因座的等位基因峰在规定范围内，阳性分型正确，阴性无基因峰，图谱清晰；2）峰高大于或等于100 RFU，视为该基因座检出；3）当检出基因座数达到13个或以上时，该检材视为“检出”DNA分型；4）结果为“检出”的检材占检材总数的比例为检材“检出率”。视为“检出”的检材图谱上包括Amelogenin在内的所有检出基因座的峰高平均值定义为该图谱的平均峰高。

2 结果与讨论

2.1 灵敏度测试

使用新鲜人血和标准DNA 2800M进行灵敏度测试。设计样本含量2800M：0.2、0.4、0.6、0.8 ng；千倍稀释血：5、10、20 μL，每种含量配制6个平行实验样本，分别使用工作站的硅珠法和磁珠法两种模式提取DNA，经扩增、电泳后得到的基因座检出数和平均峰高如表1。

根据表1，对于标准物2800M，应用硅珠法和磁珠法得到的基因座检出率差别不大，当2800M含量达到0.6 ng时，两种方法都能稳定得到全部21个基因座分型，而在2800M含量较少时（0.2、0.4 ng），磁珠法的基因座检出率比硅珠法稍高，磁珠法的平均峰高值也比硅珠法的平均峰高值大。这是因为磁珠法的整个DNA提取过程是在一个管内进行，DNA吸附在磁珠表面上，通过磁场与液体分离，分离效率极高，DNA损失率低。

表1 使用硅珠法和磁珠法提取不同含量的2800M和千倍稀释血的基因座检出数和平均峰高Table 1 The number of loci detected and the average peak height obtained from different contents of 2800M and/or 1000-dilution blood extracted with either the silicon beads or the magnetic beads

而对于硅珠法，DNA吸附于硅珠表面，洗涤过程中DNA和洗涤液的分离需通过离心实现，分离效率取决于离心的效果，一些游离的硅珠因无法聚集沉淀而随着洗涤液的去除造成DNA的损失[6]。因此整体而言，硅珠法的DNA损失率会比磁珠法稍高，在DNA含量较少的时候就会出现掉峰的情况，峰高也比较低。

对于千倍稀释血，硅珠法的提取效率明显比磁珠好，20 μL千倍稀释血应用硅珠法可以稳定得到21个基因座分型，而应用磁珠法只能得到平均16.7个基因座分型。原因或为：一方面硅珠比磁珠具有更小的粒径，在相同的体积内，硅珠具有更大的表面积，硅珠表面的修饰会更加丰富[7-8]，对于不同长度DNA片段的吸附会更加完整，而磁珠表面修饰后所能吸附DNA的范围主要集中于中大片段，人血经裂解后可能会发生片段断裂，相对于磁珠法，硅珠法能提取到更加完整的血液DNA片段；另一方面，血液成分十分复杂，包括多种蛋白质、无机盐、酶等，下面2.2节的测试显示硅珠法比磁珠法具有更好的杂质去除能力，对于血液来说，硅珠法能得到质量更好的DNA模板。

2.2 纯化能力测试

实际案件中的检材种类繁杂，同类的检材在不同的环境中所含有的杂质种类及含量也不一致，本实验采用6种案件常见的杂质进行模拟实验，杂质使用量远大于实际案件检材杂质含量，测试该平台在大剂量杂质下的纯化能力。6种杂质及使用量见表2，实验用0.8 ng 2800M和20 μL的千倍稀释血作为基础样本，每组设置一个不添加杂质的纯净样本，其余样本加入各种杂质分别使用硅珠法及磁珠法进行DNA提取，全部实验平行进行3次，得到的基因座平均检出数如图1、图2。

表2 杂质使用量Table 2 Impurities spiked and usage

由图1可以看出，对于0.8 ng 2800M，硅珠法和磁珠法检出率基本一致，除了油污和泥灰外，其余四种杂质都能检出20个以上的STR基因座（检出率>95%），与纯净样本的检出率相差不大，说明两种方法的纯化能力都很好，在含泥灰和油污的样品中，STR基因座检出数都大于16（检出率>76%），也能达到同一认定标准（13个STR基因座）。对于20 μL的千倍稀释血（图2），硅珠法对杂质的去除能力比较好，效果由好到差为：铁锈>牛仔裤>果汁>油污≈墙灰>泥灰，而磁珠法对杂质的去除能力相对来说稍差, 效果由好到差为：牛仔裤>果汁>铁锈≈泥灰>墙灰>油污。

图3和图4是纯净样本分别使用硅珠法和磁珠法提取得到的电泳图谱，当提取2800M（纯净标准DNA）时，两种方法得到的图谱均衡性都很好，当提取对象为人血（成分复杂，含有各种蛋白、无机盐及酶）时，两种方法得到的谱图均衡性也很理想，但硅珠法相对较优，这说明硅珠法去除杂质的能力较好，能得到更纯的DNA模板。

2.3 案件检材检出率

X-Pure 96 Plus微量DNA自动提取工作站在本实验室实际使用已近1年，案件接触类检材的提取主要用该工作站和全自动96道微量DNA提取工作站（博坤生物）共同完成。经统计近三个月接触类DNA检材的检验情况得到各类检材的检出率，见表3。

表3 两种方法提取三类接触检材的检出率Table 3 Detection rate of two different methods with three kinds of contact samples from cases

在检材数量较大的情况下，检材检出率具有统计学意义。表3共统计了2 664份检材的检验情况，从手足接触类及随身衣物类检材的检验情况来看，两台工作站的磁珠法检出率差异不大，手足接触类检材检出率在35%~36%之间，随身衣物类检材检出率在62%~64%之间，而硅珠法对这两类检材的检出率明显较高，分别达到40.51%和72.73%。而对于口腔接触类检材，两台工作站、两种方法之间并无明显差异。综合来说，X-Pure 96 Plus磁珠法（总检出率42.49%）和全自动96道微量DNA（博坤生物）磁珠法（总检出率45.72%）检验提取效果无明显差异，均达到了较高的提取纯化水平，而X-Pure 96 Plus硅珠法（总检出率50.39%）的提取纯化水平则表现得更为优异。

3 结论

本文测试了X-Pure 96 Plus微量DNA自动提取工作站两种提取方法，即硅珠法和磁珠法的实验效果，显示均达到了较高的纯化水平。具体而言，磁珠法由于在分离过程中DNA损失率较硅珠法低，其提取超微量DNA检材的灵敏度比硅珠法好，但硅珠法去杂质的能力更好，DNA纯度更高，所得到的图谱均衡性也更好。在实际检验中，对于状况差、杂质多或腐败严重的检材，可考虑优先使用硅珠法提取；而状况一般、杂质不多的检材，使用磁珠法则应会有更好的灵敏度；对于微量血痕，硅珠法比磁珠法更有优势。

综上所述，X-Pure 96 Plus微量DNA自动提取工作站具有较强的纯化能力和提取效率，可根据检材的类型选择合适的提取方法，以最大限度提升DNA提取的质量和效率。